地高辛配基隨機標記DNA探針法

　基因診斷是以核酸分子雜交技術為基礎，在核酸水平檢測人類遺傳性疾病的基因缺陷和一些傳染病病原體的方法。其基本過程是：制備DNA探針，標記探針，檢測樣本。開展這項工作的關鍵是要得到高靈敏度、高特異性的探針。以往人們是用放射性同位素來標記探針DNA。近年來，非同位素標記方法發(fā)展很快，已有取代同位素標記法的趨勢。地高辛配基隨機標記DNA探針法，是較為成功的一種非同位素標記方法。其原理是：用化學方法把類固醇類半抗原地高辛分子連接在dUTP上（Dig-dUTP）。用隨機引物及DNA多聚酶，以探針DNA為模板，合成互補DNA，化學修飾過的dUTP同時摻入到標記的DNA探針中。雜交后用堿性磷酸酶標記的抗地高辛單抗與標記探針DNA中的Dig-dUTP結合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉變成深棕色或藍色的化合物。

　　1．標記 　本試劑盒采用隨機引物標記方法，可標記少至10ng，多至3μg的DNA。能在新合成的DNA鏈每20～25個核苷酸，摻入一個Dig-dUTP，反應時間約為1h。
　　2．雜交 　按標準雜交方法進行。可以采用尼龍膜或硝酸纖維素膜。用過的雜交液可凍存于-20℃，重復使用。
　　3．免疫學檢測 　封阻后，檢測反應的第一步，抗體結合物與標記DNA結合，出現(xiàn)雜交的半抗原-標記DNA，顯色反應起始是在堿性pH條件下加入無色的顯色劑X-磷酸鹽和NBT，在幾分鐘內便開始出現(xiàn)藍色，顯色反應的過程持續(xù)3d。典型的例子是在24h后終止顯色反應。用二甲基甲酰胺洗掉尼龍膜上的顏色后，尼龍膜可重新用于雜交。
　　4．應用 　地高辛配基標記DNA探針及檢測試劑盒，能檢測0.1pg的同源DNA，能檢測1μg哺乳動物DAN中的單拷貝基因，與放射性標記系統(tǒng)比較，此試劑盒能快速得到實驗結果（從DNA的標記和雜交至見到檢測結果24h內能完成），而且消除了放射性的不安全問題。這試劑的靈敏度與特異性使它適用于所有的雜交技術（包括DNA-印跡轉移，菌落雜交，噬菌斑雜交及原位雜交）以替代同位素標記和放射自顯影術。

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