平板細胞克隆形成試驗

概念：

細胞克隆形成率即細胞接種存活率，表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量。貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。

基本步驟：

1、取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養液中備用。

2、將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養2～3周。

3、經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數大于10個細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。

克隆形成率 =（克隆數/接種細胞數）×100%

平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。

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