用EBV轉染淋巴細胞建立永生化細胞株的方法

一、試劑

1. 淋巴細胞分離液：避光4度保存，用前在37度水浴中加溫。整個分離過程中，溫度應控制在8-28度，溫度過高或過低均影響分離質量。

2. 全培養基（用前配置）：RPM1640培養基，內含20%胎牛血清（Gibco）{56 ℃滅活30分鐘}，1.6-1.8% 1M的HEPES，1.2% 0.2 mol/L谷氨酰胺，1%青霉素和鏈霉素。

3. 環胞酶素A（CyA）：5 ml(250 mg)/瓶，用1640培養基稀釋成0.2 mg/ml，使用時終濃度為2 ug/ml(0.5%)。

4. EBV液購自中國科學院遺傳所，儲存于零下80度。使用時從冰箱中取出，37度迅速融化，用0.22 um的濾膜過濾，不要超過0.5-1小時。

二、建株方法

1. 取外周血3-4 ml，肝素抗凝（血液室溫可放置48小時），應用液濃度5 u/ml，可加入5-10 ml外周血。

2. 將血液與等量1640培養液混勻后，沿管壁漸漸加入到含有4ml淋巴細胞分離液的離心管中（混合血：淋巴細胞分離液=6：4），3000轉離心10分鐘。

3. 吸取白細胞層，移入另一支離心管中，加入不含血清的1640培養液6ml，輕輕混勻，進行第一次洗滌。1500轉離心15分鐘。

4. 棄上清液，再加6 ml1640全培養液進行第二次洗滌，離心1500轉15分鐘。

5. 棄上清液，加入2 ml1640全培養基（全培養基加入前，置37度水浴10分鐘），然后加入環胞霉素A（4%）和1.2 mlEBV液/份，充分混勻后移入到25平方厘米的培養瓶，置37度，5%CO2培養箱中。

6. 每2-3天加入3 ml新鮮配制的培養基（1.6% 1M HEPES 緩沖液；15%胎牛血清（FBS）；1%青霉素和鏈霉素；PRMI 1640補足到100%）。7天左右鏡下觀察，可見淋巴細胞明顯增大，出現聚集現象。

7. 如果細胞增長慢，或細胞密度低，或培養液pH值呈酸性，吸出半量培養液，進行等量換液。

8. 當總量達到14 ml時轉移到75 ml培養瓶中，每2-3周加入5-10 ml新鮮培養基。

9. 約6-8周，當總量達到45 ml時，置50 ml離心管中，離心1500轉，10分鐘。棄上清，加入3 ml凍存培養基（5%二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95%FBS）混勻，成細胞懸浮液。凍存管分裝，1 ml/管，立即置零下80度，1-2小時后移入液氮罐中。

參考文獻：

1. 哈爾濱醫科大學學報，1997年8月，31卷第4期。

2. 美國斯坦福EBV轉染B細胞方法