Hela細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作步驟

1.觀察培養(yǎng)基是否正常，細(xì)胞狀態(tài)如何，細(xì)胞密度如何，決定是否傳代。觀察時擰緊蓋子。

2.加熱PBS 、versene、培養(yǎng)基，(提前做好) 瓶子不要倒著放，不要讓液體接觸到瓶塞。

3.打開超凈臺(先開風(fēng)機(jī)，后開照明)，用75%乙醇清潔臺面，點燃酒精燈。不要把廢液缸拿出去倒，如果廢液太多，可以用其他容器先裝廢液。取小離心管一個，置于架子上。

4.取尖吸管、吸量管各一支，放置在專用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要與架子接觸。

5.取待傳代的細(xì)胞。打開versene，用酒精燈外焰燒。燒吸管時距離酒精燈心遠(yuǎn)些，不要把渣滓?guī)нM(jìn)去。把試劑拿入臺子的時候，盡量平穩(wěn)，不要讓試劑碰到瓶口。

6.用吸量管吸取舊的培養(yǎng)基，置離心管中，吸量管加入versene，然后將versene瓶收起來。(加versene主要是為了將舊培養(yǎng)基洗去)。在離心管中間部分將液體加入。吸液體和加液體時都不要對著細(xì)胞。

7.打開胰酶，然后將versene棄掉。換新管，用尖吸管吸取適量胰酶加入。加胰酶后，盡快放平，使細(xì)胞消化時間一致。

8.將細(xì)胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打開PBS. 之后拿出來鏡下隨時觀察。使用二次消化法，去除容器中殘余的細(xì)胞。別忘了用舊培養(yǎng)基中和。

9.取細(xì)胞，鏡下觀察消化情況。消化程度合適之后(細(xì)胞變圓，但不漂起)，用尖吸管棄去胰酶，取離心管中的培養(yǎng)基加入細(xì)胞，吹打，至所有細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部脫落下來。用PBS洗細(xì)胞，versene對細(xì)胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至離心管中，800 rpm離心5分鐘。

10.吸量管吸取適量培養(yǎng)基加入新的培養(yǎng)皿中。

11.細(xì)胞離心畢，用吸新培養(yǎng)基的管棄去上清，先把泡沫吸走。換吸量管吸取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基適量，加入離心管，小體積混勻，將細(xì)胞重懸，尖吸管吹勻。

12.擦計數(shù)板，用槍吸10ul的液體，計數(shù)。不要把槍伸到離心管內(nèi)。

13.吸量管吸取細(xì)胞懸液，加入新的培養(yǎng)皿中。鏡下觀察，搖勻，放入37度孵育。收超凈臺。