動物細胞轉染方法

[實驗原理]

磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復合物的一種將DNA導入真核細胞的轉染方法，磷酸鈣被認為有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結合。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲作用進入靶細胞，被轉染的DNA可以整合到靶細胞的染色體中從而產生有不同基因型和表型的穩定克隆。這種方法首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改而成。可廣泛用于轉染許多不同類型的細胞，不但適用于短暫表達，也可生成穩定的轉化產物

[儀器、材料和試劑]

1　呈指數生長的真核細胞（如HeLa,BALB/c 3T3,NIH 3T3,CHO,或鼠胚胎成纖維細胞）

2　完全培養液（依所用的細胞系而定）

3　CsCl純化的質粒DNA （10～50μg/次轉染，二次純化）

4　2×HEPES緩沖鹽水(HeBS)

(pH6.95～7.05)　50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH調pH至6.95～7.05,過濾除菌后,-20℃保存備用。

5　2.5mol/L CaCl2過濾除菌,-20℃保存備用。

6　磷酸緩沖鹽水（PBS）

7　37℃，5%CO2的加濕培養箱

8　100mm組織培養平板

9　15ml錐形管

[方法與步驟]

1　傳代細胞準備　細胞在轉染前24ｈ傳代,待細胞密度達50%～60%滿底時即可進行轉染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培養液培養細胞。

2　DNA沉淀液的準備　首先將質粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空氣中晾干沉淀，將DNA沉淀重懸于μL無菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。

3 用巴斯德吸管在500μL　2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同時用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整個過程需緩慢進行，至少需持續1～2min。

4 室溫靜置30min,出現細小顆粒沉淀。

5 將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中，輕輕晃動。

6 在標準生長條件下培養細胞4～16h。除去培養液，用5ml　1×HeBS洗細胞2次，加入10ml完全培養液培養細胞。

7 收集細胞或分入培養皿中選擇培養。

經驗之談:一定是將DNA逐滴加入CaCl2,這樣轉染效率比較高一些,靜置10min后再加入2×HeBS,后有意想不到的效果。