MTT的兩個用途及原理

mtt 主要有兩個用途

1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養的細胞毒性的測定;

2.細胞增殖及細胞活性測定。

檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO )能溶解細胞中的甲臜，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細胞數量，OD 值越大，細胞活性越強(如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。

貼壁細胞：

1、收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，(邊緣孔用無菌PBS 填充)。

2.、5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況

3.、5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS 沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。

5、終止培養，小心吸去孔內培養液。

6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫 檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7、同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)

懸浮細胞

1、收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640(無血清)培養基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培養液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20);③需檢測物10ul;④細胞懸液50ul(即5×104cell/孔)，共 100ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設對照(加100ml 1640)。

2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

3、每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4 h。(懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過步驟4)，直接酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)

4、離心(1000轉x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。

5、同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)，每組設定3復孔。