封閉劑在細胞免疫熒光中的應用

• 生物實驗中的封閉劑

I、步驟：

一、固定：

PBS 5min×3次 振蕩洗滌制作好的細胞爬片。

固定液覆蓋細胞，RT 靜置15min。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

二、通透化：

通透液覆蓋細胞，RT 靜置30min。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

三、封閉：

封閉液覆蓋標本表面37℃孵育1h。

四、一抗孵育：

一抗以合適濃度稀釋PBS，覆蓋標本表面。

4℃孵育過夜，第二天37℃復溫1h。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

五、二抗孵育：

FITC標記二抗以合適濃度稀釋于PBS，覆蓋標本表面。

37℃避光孵育<60min。

PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。

六、染核：

新鮮稀釋Hoechst覆蓋細胞表面，RT避光靜置<10min。

PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。

七、封片：

在干凈的載玻片上滴一滴封片劑，將爬片的細胞面扣在封片劑上。

八、鏡檢，4℃避光保存。

II、注：

1、細胞密度要合適，狀態較好。

2、從孵育二抗開始要避光(關閉室內日光燈即可)。

3、完成后最好及時鏡檢，照相;分別用不同波長激發熒光，在Photoshop軟件下合成一張圖。

III、試劑配制：

1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：

4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加熱至60℃，持續攪拌至完全溶解，(通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮)，定容100ml，RT保存。

2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS

3、封閉液：正常山羊血清稀釋于PBS;或商品化封閉液成品。

4、Hoechst：Hoechst33258即可。

5、封片劑：50%(v/v)甘油/PBS。