熒光標記法檢測細胞凋亡的操作步驟

一、儀器與試劑

1. TdT酶(25U/μl);

2. 生物素標記的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標記的dUTP (Digoxingening-11-dUTP)1nmol/μl;

3. 反應緩沖液;

4. 洗滌緩沖液;

5. 異硫氰酸熒光素(FITC)標記的親合素或鏈霉親合素 (2.5μg/ml)或抗地高辛抗體(1:30);

6. PI染液(含PI 5μg/ml及0.1%無DNA酶活性的RNA酶);

7. PBS 緩沖液;

8. 塑料蓋玻片;

9. 貼壁生長的培養細胞;

10. 懸浮生長培養細胞的甩片或涂片;冰凍切片;常規石蠟切片。

二、操作步驟

1. 固定：培養細胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃冰箱)后，用80%酒精再固定2h(-20℃冰箱);常規4%中性福爾馬林固定、石蠟切片進行脫蠟、水合;

2. 洗滌：將玻片浸入PBS 緩沖液，搖床上洗滌5min，三次;

3. 反應：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細胞 或組織周圍水分，按50μl/cm2 滴加反應液(每50μl反應液含TdT酶0.5μl ，標記的-dUTP 1μl)，使反應液均勻地覆蓋于所有細胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37℃孵育1h;

4. 終止反應：去掉塑料蓋玻片，將玻片置于盛有洗滌緩沖液的染色缸內，洗滌2次，每次5min;

5. FITC標記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加FITC反應液(含FITC 2.5μg/ml)，室溫下避光孵育10min;

6. 洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內，洗2次，每次5min;

7. PI復染：將玻片置于盛有PI染液的染色缸內，室溫下避光染色30min

8. 封片：用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上，亦可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，盡早鏡檢觀察;

三、結果判斷

用熒光顯微鏡觀察，選用藍色激發光(波長488nm)，所有的細胞核 均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細胞被特異地標記上FITC，顯示出黃綠色熒光。