從RNA中提取mRNA的方法
采用Promega公司的PolyATract? 26reg；mRNA Isolation System III。
使用該試劑盒，mRNA產(chǎn)量極低，因此下述方法是以Promega公司試劑盒操作手冊(cè)為基礎(chǔ)，并采用儲(chǔ)昭暉碩士（作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物分子生物學(xué)水稻分室）所建議的改進(jìn)方法綜合而成。
由使用者自備的材料
65℃水浴
無(wú)菌的、無(wú)RNase的1.5ml塑料離心管
無(wú)菌的、無(wú)RNase的加樣槍和槍頭
操作步驟
1. 探針的退火
① 在一個(gè)無(wú)菌的、無(wú)RNase的離心管中，加入未稀釋的總RNA溶液，使終體積達(dá)到1.5ml。可使用更大量的總RNA，其濃度可至過(guò)飽和，即有絮狀RNA沉淀析出，但當(dāng)有絮狀RNA沉淀存在時(shí)，后續(xù)的退火反應(yīng)操作會(huì)受到一定程度影響；也可使用更少量的總RNA（50ug），但mRNA產(chǎn)量可能無(wú)法保證。
② 將離心管置于65℃水浴中10分鐘或略長(zhǎng)時(shí)間。
③ 加入15ul 的Biotinylated-Oligo（dT）探針和39ul的20%×SSC到RNA中。顛倒數(shù)次以混勻，靜置于室溫下至充分冷卻。這將需要10分鐘或略少的時(shí)間。在該溶液冷卻期間，制備0.5%× 和0.1%×SSC貯存液
2. 貯存液制備
① 通過(guò)在三個(gè)無(wú)菌的、無(wú)RNase的離心管中各自混合30ul的20%×SSC和1.170ml的無(wú)RNase的水來(lái)制備三份1.2ml的無(wú)菌的0.5%×SSC。
② 通過(guò)在三個(gè)無(wú)菌的、無(wú)RNase的離心管中各自混合7ul的20%×SSC和1.393ml的無(wú)RNase的水來(lái)制備三份1.4ml的無(wú)菌的0.1%×SSC。
3. 鏈霉抗生物素蛋白-磁珠（Streptavidin-Paramagnetic Particles）的漂洗
① 取三管鏈霉抗生物素蛋白-磁珠，輕彈離心管的底部使SA-PMPs重懸直至其充分分散，吸取懸液合并于一管。
② 使匯總的SA-PMPs重懸直至其充分分散，然后將離心管置于磁柱中直至SA-PMPs已經(jīng)聚集在離心管壁上（大約30秒）。小心地移出上清。不要離心沉淀顆粒。
③ 用0.5%× SSC漂洗SA-PMPs三次（每次0.9ml），每次都使用磁柱來(lái)捕獲它們，然后小心地移去上清。
4）重懸漂洗過(guò)的SA-PMPs于0.3ml的0.5%×SSC中。
4. Oligo（dT）-mRNA退火雜合體的捕獲和漂洗
① 將退火反應(yīng)的全部成分加入到含有漂洗過(guò)的SA-PMPs的離心管中。
② 室溫下靜置10分鐘。每1-2分鐘輕柔地顛倒一次以混勻。
③ 用磁柱捕獲SA-PMPs，小心移去上清，注意不要攪動(dòng)SA-PMPs顆粒。當(dāng)總RNA為過(guò)飽和高濃度時(shí)溶液時(shí)，退火反應(yīng)易形成黑色絮狀物，磁柱吸附也難以壓縮其體積，這時(shí)應(yīng)小心吸取上清；保留上清直至確信mRNA的結(jié)合與洗脫已是令人滿意。
④ 用0.1%×SSC（每次0.9ml）漂洗顆粒4次，其間輕彈離心管底部直至顆粒已被重懸。最后一次漂洗后，在不攪動(dòng)SA-PMPs的前提下，以8000rpm離心1分鐘，盡可能多地移出液相。
5.mRNA的洗脫
① 為洗脫mRNA，將最終的SA-PMPs重懸于0.1ml的無(wú)RNase的水中，溫柔地輕彈離心管以重懸顆粒。
② 65℃水浴2分鐘。
③ 用磁場(chǎng)捕獲SA-PMPs，8000rpm離心30秒。
④ 將含有洗脫的mRNA的液相移入一無(wú)菌的、無(wú)RNase的離心管中。勿將顆粒丟棄。
⑤ 重懸SA-PMP顆粒于0.15ml的無(wú)RNase的水中，65℃水浴2分鐘，用磁場(chǎng)捕獲SA-PMPs，8000rpm離心2分鐘。將洗脫液與5. ④ 步驟中洗脫的mRNA合并。
⑥ 如果這時(shí)有任何顆粒也被攜帶到終溶液中，可用10,000×g，4℃，5-10分鐘的離心來(lái)去除。小心地將RNA轉(zhuǎn)入一新鮮的無(wú)RNase的離心管中。
6.mRNA的濃縮
① 加入等體積異丙醇，混勻。通常立刻有肉眼可見(jiàn)之沉淀生成，立即以12000rpm離心10分鐘，沉淀mRNA。或根據(jù)沉淀生成的難易，-20℃放置數(shù)小時(shí)或過(guò)夜再沉淀。
② 小心倒去異丙醇，加75%乙醇洗滌。
③ 小心倒去75%乙醇，室溫干燥。
④ 將mRNA溶于20ul無(wú)RNase的水中。注意管壁上通常會(huì)粘附大量mRNA沉淀，用槍頭吸取水滴在管壁上滾動(dòng)數(shù)次以盡可能回收mRNA。
