RNA的斑點雜交--樣本RNA點膜

一、試劑與儀器

1. 20×SSC（標準檸檬酸鹽緩沖液）（pH 7.0）

NaCl 175.3g

檸檬酸鈉 88.2g

加H2 O至 1000ml

用10N NaOH or 10N HCl調pH至7.0，高壓滅菌。

2. 37%甲醛

3. 甲酰胺

4. 2×Denhardt液

5. 硝酸纖維素膜

6. 多孔過濾加樣器和真空泵

7. 恒溫水浴搖床

8. 加樣器和吸頭等

二、操作步驟

1. 樣本RNA變性：

20 μl RNA溶液（2μgRNA）

4 μl 20×SSC

14 μl 37%甲醛

40 μl 100%甲酰胺

將上述溶液均勻，置60℃溫育30 min，冰浴冷卻樣品，使樣本RNA變性。在上述RNA液體中每100 ul液中加210 ul 20×SSC（共310 ul），作為點樣溶液，點樣時每孔加150 ul。

2. 纖維素膜處理：硝酸纖維素膜（0.45 um）水中浸泡5 min，再用20×SSC室溫浸泡1h。

3. 濾器的處理及點樣：用0.1 M NaOH浸泡（洗）多孔過濾加樣器，再用滅菌水徹底沖洗。將纖維素膜壓在多孔加樣器的上層板的上面，再壓在下層板上，趕去氣泡，然后兩部分夾緊，點樣前，先用20×SSC（200 μl）洗一遍每個孔，真空抽吸干凈后，再分別點樣。

如有未點樣孔須用150 ul 的20×SSC封住其孔，然后用真空泵抽吸干凈，再用20×SSC清洗一次，待流體濾過纖維膜后，繼續抽吸5 min 以干燥濾膜。

4. 取出膜，80℃烤2~3 h，膜保存于-20℃。