動物組織樣品RNA的抽提

動物組織樣品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提過程中降解，以及盡可能得到最高的RNA抽提效率。以下介紹我們實驗室認為最符合以上兩個要素的抽提方法。

一、實驗材料：

Trizol試劑

研缽，勻漿器，鑷子，鋁箔都高溫滅菌即可；

二、具體過程：

1、樣品在離體后應迅速冷凍在液氮中，若是比較大塊的組織，要盡量把組織剪切成黃豆大小的塊，使液氮迅速滲透到組織內部而防止組織內部的RNA降解。組織用鋁箔包好或放入凍存管中，并做好記號，注意不要把記號寫在紙上，以防紙被組織的血水滲透而導致記號模糊。可以把鋁箔放入紗布袋并儲存在液氮中。

2、在抽提RNA前，先把研缽預冷，往研缽內反復加入液氮，至少4-5次，使研缽充分預冷。從液氮罐中取出樣本后，把組織塊放入已預冷的研缽中進行研磨，邊研磨邊加液氮（圖1），整個過程都不要使液氮揮干。一次研磨的組織塊重量不要超過300mg。

圖1 用研缽在液氮中把樣品研成粉末

3、研磨到組織樣品成粉末狀后（一般需要8-10min的研磨過程），在液氮基本揮發完時，在每個研缽中加2-3ml Trizol試劑。由于此時研缽很冷，Trizol加入后會凍結成固體狀（圖2）。可以繼續研磨此固體成粉末（圖3），隨著研缽溫度回升到室溫，固體狀的Trizol逐步回復到液體狀態（圖4），此時，若發現液體很粘，研杵能牽起絲狀物，說明Trizol的量太少，需在此步繼續補加Trizol。若Trizol的量過少，會導致抽提的RNA中有較多的基因組DNA污染。由于Trizol試劑中含有強烈的RNA酶抑制劑，因此組織樣品和Trizol充分研磨混勻后就不用擔心RNA的降解了。

圖2 在冰冷的研缽中加入Trizol試劑后          

圖3 繼續把成固體狀的Trizol進行研磨，Trizol試劑會凍結成固體   

圖4 隨著研缽的溫度回復到室溫，Trizol試劑逐步又變為液體

4、把此Trizol試劑轉移到玻璃勻漿器中，再進一步勻漿3-5min（圖5）。

圖5 Trizol試劑轉移到玻璃勻漿器中，再進一步勻漿

5、再把Trizol試劑轉移到1.5ml離心管中（圖6），后續可以按照Trizol試劑的標準操作抽提總RNA。

圖6 把Trizol試劑轉移到1.5ml的離心管中

說明：

1、研磨，勻漿過程中使用過的器具放入八四消毒液中浸泡消毒一天后，再用洗滌靈洗刷干凈晾干后泡酸過夜，洗刷晾干后包上鋁箔高壓滅菌后，180℃烘烤4小時以備下次使用。

2、此方法看上去過程雖然比較繁瑣，但得到的RNA質量好，抽提的RNA量比其他方法要高，比如米粒大的胃鏡標本平均能提出約10 g總RNA，足夠做一張人22K全基因組芯片了。得到的RNA的電泳檢測圖片如圖7。 3、另外在我們的工作中，接觸到一些用戶在取了組織后，馬上凍到-70℃冰箱來保存，然后提取RNA做反轉錄，這樣的樣品中RNA往往有較大的降解，用來做一些基因的RT-PCR還可以，但若做芯片工作就不行了。要盡量先液氮速凍。

圖7 用以上方法抽提胃鏡標本的RNA甲醛變性膠電泳圖