表皮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

原理

利于皮膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)成功的因素有，在有膠原的底物上易生長(zhǎng)；另有人發(fā)現(xiàn)把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）上時(shí)，細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。向培養(yǎng)基中加氫化可的松（ 10 μg/ml ）、10-10 的霍亂毒素、10M-6 的異丙基腎上腺素（Isopro-terenol）和10 ng/mI 促表皮生長(zhǎng)因子（EGF）能促表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。

材料與儀器

皮膚 血清
EDTA 胰蛋白酶 Eagle
血管鉗 吸管 CO2溫箱

步驟

皮膚是皮表細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)源，小兒包皮是皮膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)的好材料。全皮培養(yǎng)時(shí)，表皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合生長(zhǎng)，難以純化。黑木登志夫（1981）用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲純上皮細(xì)胞，有一定參考價(jià)值，其法如下：

1.  取材
取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成 0.5~1 平方厘米小塊；

2.  EDTA處理
先置入0.02 %EDTA 中室溫置5 分鐘；

3.  冷消化
換入0.25 %胰蛋白酶中，置4 ℃過(guò)夜；

4.  分離
取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開(kāi)；

5.  溫消化
取出表皮單獨(dú)處理，用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25 %胰蛋白酶中，37 ℃再消化30~60 分鐘；

6.  用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液；

7.  培養(yǎng)液
通過(guò)80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle液和 20 %小牛血清，制成細(xì)胞懸液，接種入碟皿中，CO2溫箱培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散，如冷消化后分離下來(lái)的表皮膜自身也已松散，此時(shí)亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過(guò)第二次消化。

常見(jiàn)問(wèn)題

皮膚表皮培養(yǎng)亦可用全皮消化法或組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。用膠原酶消化為好，它對(duì)結(jié)締組織有較強(qiáng)消化作用，對(duì)表皮細(xì)胞損傷小，但成纖維細(xì)胞易與上皮細(xì)胞同時(shí)生長(zhǎng)，在這種情況下，需做排除成纖維胞處理。血清中含有血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子（PDGF），易促成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)；如用好的、不含PDGF的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可能更好。