,,

中國微生物菌種
和
標準物質(zhì)查詢網(wǎng)

China microbial strains and
reference materials query network

會員登錄會員注冊

我已閱讀并同意《服務協(xié)議》

注冊

植物組織中DNA和RNA的提取和鑒定

發(fā)布日期：2022-07-09 19:26:10

植物組織中DNA和RNA的提取和鑒定

一、實驗目的

①學習和掌握從植物組織中分離核酸的原理和操作方法。

②學習和掌握測定核酸含量的定糖法(苔黑酚法和二苯胺法)的原理及操作方法。

二、實驗原理

核酸是生物體內(nèi)的主要化學成分，核酸在生物體內(nèi)主要以核蛋白的形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸 (DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA主要存在與在細胞核中，RNA主要存在于細胞質(zhì)中。

用冰冷的稀三氯乙酸或高氯酸溶液在低溫下抽提菜花勻漿，以除去酸溶性小分子物質(zhì)。再由有機溶劑如乙醇、乙醚等抽提，去除脂溶性的磷脂等物質(zhì)。最后用濃鹽溶液(10%氯化鈉溶液)和0.5mol/L高氯酸(70℃)分別提取DNA 和RNA。

由于核酸和脫氧核糖核酸有特殊的顏色反應，經(jīng)顯色后所呈現(xiàn)的顏色深淺在一定范圍內(nèi)和樣品中所含的核糖和脫氧核糖的量成正比。因此可用定糖法來定性定量測定核酸。

① 核糖的測定：測定核糖的常用方法是苔黑酚法(3，5—二羥基甲苯，即Orcinol反應)。當含有核糖的RNA與濃鹽酸及3，5—二羥基甲苯在沸水水浴中加熱10～20min后，有綠色物產(chǎn)生，這是因為RNA脫嘌呤后的核糖與酸作用生成糠醛，后者再與3，5—二羥基甲苯作用生成綠色物質(zhì)。

RNA+濃硫酸+ 綠色化合物

注意：DNA、蛋白質(zhì)和黏多糖等物質(zhì)對測定有干擾作用。

② 脫氧核糖的測定：測定脫氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脫氧核糖的DNA在酸性條件下和二苯胺在沸水浴中共熱后，產(chǎn)生藍色。這是因為DNA嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-6-酮基戊醛，再與二苯胺作用產(chǎn)生藍色物質(zhì)。

DNA+少量濃硫酸或冰乙酸+ 藍色物質(zhì)

注意：DNA、蛋白質(zhì)和黏多糖等物質(zhì)對測定有干擾作用。

此法易受多種糖類及其衍生物和蛋白質(zhì)的干擾

上述兩種定糖的方法準確性較差，但快速簡便，能鑒別DNA和RNA，是鑒定核酸、核苷酸的常用方法。

三、實驗器材

① 恒溫水浴

② 電爐

③ 布氏漏斗裝置

④ 移液管

⑤ 燒杯

⑥ 量筒

⑦ 剪刀

⑧ 研體

四、材料和試劑

① 新鮮菜花

② 95%乙醇

③ 丙酮

④ 5%高氯酸溶液

⑤ 0.5mol/L三氯酸溶液

⑥ 10%氯化鈉溶液

⑦ 標準RNA溶液(5mg/100mL)

⑧ 標準DNA(15mg/100ml)

⑨ 粗氯化鈉

⑩ 海沙

? 二苯胺試劑：將1g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，再加入2.75mL濃硫酸(置冰箱中可保存6個月。使用后，在室溫下?lián)u勻)。

? 三氯化鐵濃鹽酸溶液：將2ml10%三氯化鐵溶液(用FeCl3·6H20配制加入到)400mL濃鹽酸中。

五、操作方法

1. 核酸的分離

①取菜花的花冠20g，剪碎后置于研缽中。加入20mL 95%乙醇和少量誨砂，研磨成勻漿。然后用布氏漏斗抽濾，棄去濾液。

②向濾渣中加入20mL丙酮，攪拌均勻,抽濾，棄去濾液。

③再向濾渣中加人20mL丙酮，攪拌5min后抽濾(用力壓濾渣，盡量除去丙酮)。

④在冰鹽浴中，將濾渣懸浮在預冷的20mL 5%高氯酸溶液中攪拌抽濾棄去濾液。

⑤特濾渣懸浮于20mL 95%乙醇中，抽濾，棄去濾液。

⑧濾渣中加入20mL丙酮，攪拌5min。抽濾至干.用力壓濾渣盡量除去丙酮。

⑦將干燥的濾渣重新懸浮在40ml10%氯化鈉溶液中，在沸水浴中加熱15mln，放置、冷卻，抽濾至干，留濾液，并將此操作重復進行一次。將兩次濾液合并，為提取物一。

⑧將濾渣重新懸浮在20mL 0.5mol兒高氯酸溶液中。加熱到70℃。保溫20 min(恒溫水浴)后抽濾。留濾液為提取物二。

2.DNA和RNA的定性鑒定

①二苯胺反應：按表1加入各種試劑，反應后觀察現(xiàn)象井記錄結(jié)果。

表1 二苯胺反應加入試劑

管號	1	2	3	4	5
蒸餾水/ml	1	-	-	-	-
DNA溶液/ml	-	1	-	-	-
RNA溶液/ml	-	-	1	-	-
提取物一/ml	-	-	-	1	-
提取物二/ml	-	-	-	-	1
二苯胺試劑/ml	2	2	2	2	2
放沸水浴中10min后的現(xiàn)象

②苔黑酚反應：按表2加入各種試劑，反應后觀察現(xiàn)象井記錄結(jié)果。

表2 苔黑酚反應加入試劑

管號	1	2	3	4	5
蒸餾水/ml	1	-	-	-	-
DNA溶液/ml	-	1	-	-	-
RNA溶液/ml	-	-	1	-	-
提取物一/ml	-	-	-	1	-
提取物二/ml	-	-	-	-	1
三氯化鐵濃鹽酸溶液/ml	2	2	2	2	2
苔黑酚乙醇溶液/ml	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
放沸水浴中10-20min后的現(xiàn)象