真核細胞轉染操作步驟

一些真核蛋白在原核宿主細胞中的表達不但行之有效而且成本低廉，然而許多在細菌中合成的真核蛋白或因折疊方式不正確，或因折疊效率低下，結果使得蛋白活性低或無活性。不僅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻譯后加工，例如二硫鍵的精確形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進行的裂解等等，而這些加工原核細胞則無能為力。需要表達具有生物學功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于細胞膜 表面的受體或細胞外的激素和酶，則更需要使用真核轉染技術。由于DNA導入哺乳動物細胞有關技術方法的發展，使真核表達成為可能。

利用克隆化的真核基因在哺乳動物 細胞中表達蛋白質，具有以下多種不同用途：

(1) 通過對所編碼的蛋白質進行免疫學 檢測或生物活性測定，確證所克隆的基因。

(2) 對所編碼的蛋白質須進行糖基化或蛋白酶水解等翻譯后加工的基因進行表達。

(3) 大量生產從自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。

(4) 研究在各種不同類型細胞中表達的蛋白質的生物合成以及在細胞內轉運的情況。

(5) 通過分析正常蛋白質及其突變體的特性，闡明蛋白質結構與功能的關系。

(6) 使帶有內含子而不能在原核生物如酵母中正確轉錄為 mRNA的基因組序列得到表達。

(7) 揭示某些與基因表達調控有關的DNA序列元件。

DNA轉染技術現已變成研究基因功能和組分的重要工具，已發展了很多轉染方法，并成功應用于轉染各種細胞。目前廣泛應用方法有磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、病毒載體，以及陽離子脂質體介導轉染法。

進行真核轉染的一般程序：

克隆目的基因(經測序驗證)-準備真核表達載體-將目的基因插入表達載體中-轉染-篩選-鑒定

下面以pcDNA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉染的實驗操作。

一、試劑準備

1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,調pH到7.4,補ddH2O至100ml, pH7.4，濾過除菌。

2、核酸貯存液，過濾除菌。

3、培養基：含血清或不含血清的，用于轉染細胞的正常培養。

二、操作步驟

(一)克隆目的基因

1、根據GenBank檢索的目的基因序列，設計擴增引物，并在上、下游引物的5’-端分別引入酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。

2、回收特異性擴增片段，連入T載體。

3、轉化DH5α，質粒制備。

4、酶切初步鑒定，測序證實。

(二) 真核重組表達載體的構建：

pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復制的原核序列、便于挑選帶重組質粒細菌的抗生素抗性基因，以及表達外源DNA序列所必需的所有真核表達組件。

重組質粒與pcDNA3分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切

回收插入片段和pcDNA3線性片段

T4連接酶連接

轉化DH5α

質粒制備

BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。

(三)重組pcDNA3轉染SHG-44細胞：

1、 G418篩選濃度測定：SHG-44培養于24孔培養板→G418 分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各濃度3復孔，設正常對照3復孔。以10-14天細胞全部死亡的濃度為篩選濃度，結果為200mg/L。

2、 在轉染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉染當天細胞應達到60%-80%覆蓋。一般要求，6孔培養皿(35mm)，每孔1-2ml培養基3×105細胞。依據不同大小培養板調整每平方厘米的細胞數量。

典型貼壁細胞平板密度

3、 SHG-44細胞的轉染：

(1) 轉染當天，加入脂質體/ DNA混合物之前的短時間內，更換1ml新鮮的有血清或無血清培養基。

(2) 準備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個細胞系的最佳比例。

① 溶液A：用HBS稀釋DNA(pcDNA3、重組pcDNA3)各1.5μg 到總體積50μl(30μg/ml)。

②溶液B：用HBS稀釋6μl脂質體到終容積50μl(120μg/ml)。

③混合溶液A和B，輕柔混合(不要振蕩)，室溫孵育15min，以便脂質體/DNA混合物形成。

(3) 不要移去培養基，逐滴加入100μl 脂質體/DNA混合物(從培養孔一邊到另一邊)，邊加邊輕搖培養板。

(4) 37℃孵育6hr。

(5) 6hr后更換轉染培養基，加入2-3ml新鮮生長培養基。

(6) 轉染24hr后施加篩選壓力，改用含G418的培養基培養。

4、 G418篩選：在G418篩選濃度下持續培養14天后，挑出單克隆，擴大培養，同時轉染pcDNA3即SHG-44-vect，并設對照組細胞即SHG-44。

(一)篩選結果鑒定：

(1)基因組DNA提取→PCR鑒定外源基因

(2)SHG-44-重組pcDNA3陽性細胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝膠電泳→免疫印跡鑒定P16蛋白表達(Western-blot)。

(3)測定外源性基因對SHG-44細胞增殖的影響

①流式細胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→單細胞懸液→70%酒精固定→裂解細胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機分析G1期和G2/M、S期比例。

②細胞生長曲線測定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→5×104/孔接種24孔培養板→24hr后各自用苔盼藍染色計數細胞→計算細胞生長抑制百分率。

③軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→104 細胞→0.3%低熔點瓊脂糖培養→1-2周后計數不可少于50個細胞的克隆數→計算克隆形成率抑制率。

三、注意事項

1、優化轉染條件(脂質體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質體和DNA混合孵育時間)每種細胞和質粒均須進行。用于轉染的核酸應高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用應在無菌條件下，這是細胞慣常的做法。但是，脂質體以及脂質體/ DNA混合物無需濾過除菌。

2、預備脂質體/DNA混合物必須在無血清下進行。但是在隨后的脂質體/ DNA與被轉染細胞共孵育的過程中，血清又是培養基的一部分。

3、在轉染之前更換培養基，可提高轉染效率，但所用培養基必須37℃預溫。

脂質體/ DNA混合物應當逐滴加入，盡可能保持一致，從培養皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。