流式胞內染色protocol

一、surface marker染色

1、收獲細胞，0.5-1x10e6/tube，用FACS Buffer 2ml洗滌一次，傾倒后濾紙吸干管口液體。

2、加入預先配置好的你需要染的surface marker的抗體混合液（即CD3，CD4，CD8抗體mixture），充分混勻，室溫下孵育20分鐘。

3、FACS Buffer 2 ml洗滌一次傾倒后濾紙吸干管口液體。

二、Intracellular Staining的步驟

1、加入Fix/permeabilizatioin Buffer（不同公司有各自的試劑，ebioscience或者BD，看你的抗體是那個公司的，但是操作流程大致相同）

2、加入Fix/Perm Buffer 250ul 后，混勻，4度孵育30分鐘（公司可能推薦1ml，我一直加250ul，絕對可行）或者室溫15～20分鐘

3、用公司配套的Perm Wash Buffer 1x的2ml洗滌1-2次，本人一直洗一次節約試劑，也沒有問題

4、如果有Isotype染色的，需要加Normal Rat Serum 4ul 進行blocking，混勻，室溫下孵育15分鐘

5、如果不做Isotype，第4步可以省略

6、不必洗滌，直接加入細胞因子抗體，室溫下孵育30-60分鐘，我建議是60分鐘，比30分鐘好，你也可以自己摸條件

7、最后再用1xPerm Wash Buffer 2ml洗一次，傾倒后，加入適量FACS Buffer就可以過流式了。