微生物培養過程中如何避免雜菌，常用的滅菌方法有哪些？

滅菌是指通過特定工藝，消除材料或培養基中存活微生物的過程。滅菌與消毒、清潔、巴氏殺菌及抗菌處理等概念有區分，后者僅能針對部分微生物。消毒是指殺滅或清除傳播媒介上的病原微生物，使之達到無害化的處理。根據有無已知的傳染源可分預防性消毒和疫源性消毒；根據消毒的時間可分為隨時消毒和終末消毒。滅菌可通過熱力、化學、輻射或過濾等方法實現。

滅菌體系

加熱滅菌

熱力滅菌的主要方法包括

1）濕熱（飽和蒸汽）滅菌

2）干熱（熱空氣）滅菌

熱量通過使蛋白質變性和凝固來殺滅微生物。濕熱滅菌相比干熱滅菌具有速度更快、所需溫度更低的優勢。濕熱滅菌是培養基滅菌最常用的方法，若正確使用，它是一種經濟、安全且可靠的滅菌方式。

濕熱滅菌

水在100°C時沸騰，但要在合理時間內，殺滅具有抗性的細菌孢子，則需要更高溫度。121°C維持15分鐘是被廣泛認可的滅菌標準條件，適用于不超過1.0L的培養基滅菌。

"121°C高壓滅菌15分鐘"的定義是指，容器內物品保持在121°C達15分鐘，而非滅菌器設定的溫度和時間。在此溫度下，蒸汽壓力有助于熱量滲透至待滅菌物品內部。若需對更大容量的單一容器進行滅菌，則應延長滅菌時間。多項因素會影響滅菌效果，包括滅菌物品的體積與內容物特性、干燥及冷卻時間等。

某些成分可能在較高溫度和較長滅菌周期下發生分解，因此必須對所有滅菌程序，進行嚴格驗證以確保有效性。

滅菌工藝驗證與認證的基本原則，包括以下要點：

1. 確認處理設備，具備在設定參數范圍內運行的能力；

2. 驗證關鍵控制設備及儀器，可在工藝要求參數范圍內正常運行；

3. 使用實際產品或模擬產品進行重復工藝驗證：確保所有操作均在規定規程范圍內完成，最終驗證微生物存活概率不超過規定限值；

4. 日常運行中持續監控已驗證工藝，并定期進行設備再確認與再認證；

5. 完整記錄上述驗證過程的所有規程與步驟。

注：有關工藝驗證的完整說明，請參考相關專業文獻。

確保溫度記錄準確至關重要，必須使溫度達到待滅菌物品的所有部位并維持所需時長。滅菌腔室需使用記錄式溫度計進行監測，同時可在物品內部埋設熱電偶進行溫度測量。

濕熱滅菌：立式滅菌器

為確保培養基滅菌效果最佳，需用非脫脂棉或透氣蓋，對液體試管及燒瓶進行松塞處理。試管應置于專用支架或松散擺放在滅菌籃內，燒瓶盛裝液體不得超過其容積的三分之二。滅菌操作時需注意：裝載量不得超過高壓滅菌腔室容量，物品擺放須確保蒸汽可自由循環。液體滅菌完成后必須緩慢降壓至常壓狀態，待溶液溫度降至常壓沸點以下方可開啟艙門，此舉可有效防止液體暴沸現象發生。

在高壓滅菌器運行過程中，必須將滅菌腔室內的空氣完全排出，并由蒸汽替代，否則會出現"熱點"和"冷點"現象。下表顯示了正確操作的高壓滅菌器的壓力-溫度對應關系。

過度滅菌或長時間加熱會改變培養基的成分。例如，碳水化合物在過熱情況下會發生分解。過度滅菌培養基可能導致諸多問題，包括：

? pH值異常

? 瓊脂凝膠強度下降

? 產生非典型沉淀物

? 培養基焦糖化或顏色加深

? 營養成分流失

? 選擇/鑒別特性喪失

某些培養基（如Hektoen腸道瓊脂和紫紅膽鹽瓊脂）不可采用高壓滅菌。配制此類培養基時，需加熱至完全沸騰溶解。必須嚴格遵守每種培養基標簽標注的配制說明。培養基添加劑應預先滅菌，并在無菌條件下添加到已滅菌的培養基中，添加溫度通常控制在45-55°C為宜。

干熱滅菌

干熱滅菌法適用于以下材料：可能被濕熱腐蝕的金屬器械、粉末、軟膏以及蒸汽難以穿透的致密材料。由于干熱滅菌需要比濕熱滅菌更高的溫度和更長的時間才能達到效果，因此該方法僅限于培養基等不耐高溫物品以外的材料。干熱滅菌的標準條件為160°C下維持120分鐘。

化學滅菌

化學滅菌法采用氣態和液態滅菌劑，對特定醫療及工業器械進行滅菌處理。常用滅菌氣體，包括環氧乙烷、甲醛和β-丙內酯；液態滅菌劑，則包含戊二醛、過氧化氫、過氧乙酸、二氧化氯及甲醛等。由于化學滅菌會影響培養基性能，故不適用于培養基制備。如需深入了解該主題，請參閱相關專業文獻。

輻射滅菌

輻射滅菌是熱敏感材料的可選處理方法，主要包括紫外線和電離兩種方式。

紫外線具有化學活性，能夠激發微生物細胞內原子（特別是核酸）的電子躍遷，從而產生致死性突變。這種作用會阻斷微生物的繁殖能力。具有殺菌效力的紫外線波譜范圍為240-280納米。不同微生物對紫外線輻射的敏感性存在顯著差異：黑曲霉孢子的抗性強度是枯草芽孢桿菌孢子的10倍，是金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的50倍，更是流感病毒的150倍。

由于大多數材料會強烈吸收紫外線，其穿透能力有限，因此紫外線滅菌僅適用于表面處理。相比之下，電離輻射（包括γ射線、高能X射線和高能電子束）產生的能量要高得多，可達紫外線能量的100倍至數百萬倍。

電離輻射與紫外線不同，能深入穿透原子內部引起電子電離。其滅菌機制具有雙重作用：既可直接作用于細胞DNA，也能通過產生的活性離子和自由基與DNA發生間接反應。

在滅菌應用領域，γ射線的使用頻率高于X射線或高能電子束。γ射線由放射性同位素產生，其中鈷-60是最常用的輻射源。采用γ射線滅菌需要持續數小時的輻照時間。γ輻照滅菌工藝的驗證主要包括以下內容：

? 確認待滅菌物料的輻射兼容性；

? 確定產品裝載方式并完成滅菌容器內的劑量分布測繪；

? 設定輻照時間參數；

? 驗證所需滅菌劑量的準確投遞。

輻射滅菌技術具有多重優勢：化學反應活性低、可檢測殘留物極少，且過程控制變量少。γ射線輻照適用于多種熱敏感產品的滅菌處理，這些產品同樣可采用氣體滅菌法，包括醫療器材與設備、藥品、生物制品及實驗室器具等。

過濾滅菌

過濾法是對液體和氣體進行滅菌的有效方法，其原理是通過物理阻隔，而非滅活的方式去除微生物。主要采用兩類過濾器：深層過濾器和膜式過濾器。

膜式過濾器通過篩分作用截留顆粒物，而深層過濾器則依靠吸附滯留作用。膜式過濾器的篩分效能主要取決于濾膜孔徑尺寸，同時靜電力作用也至關重要。平均孔徑0.8μm的膜過濾器可截留小至0.05μm的顆粒物。細菌濾除通常采用0.2μm孔徑，而病毒和支原體的截留則推薦使用0.01-0.1μm孔徑范圍。球菌和桿菌的直徑約0.3-1μm，大多數病毒尺寸為0.02-0.1μm，部分病毒可達0.25μm。

過濾除菌

濾膜孔徑的評級采用名義孔徑標準，該標準反映濾膜截留特定菌株尺寸微生物的能力。滅菌級濾膜需滿足以下要求：在≥30 psi壓力下，每平方厘米膜表面能100%截留濃度達10?個/平方厘米的缺陷假單胞菌（Pseudomonas diminuta，ATCC? 19146）培養物。此類濾膜的名義孔徑額定為0.22μm或0.2μm。而細菌級濾膜（亦稱分析級濾膜）僅能截留較大微生物，其名義孔徑額定為0.45μm。

膜式過濾器在商業化制藥生產中具有重要應用，主要用于熱敏感藥物溶液和注射劑的滅菌處理。該技術特別適用于細菌和病毒培養基所用血清的除菌過濾，以及受熱易分解糖類溶液的滅菌。此外，膜過濾技術還被廣泛應用于藥品和醫療產品的無菌檢測領域。

無菌保證

無菌保證度（Sterility Assurance）是指微生物在滅菌處理后仍存活的概率估值，通常以無菌保證水平（SAL，Sterility Assurance Level）或"滅菌程度"來衡量。在濕熱滅菌驗證中，采用含有耐熱孢子的嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）作為生物指示劑，在121°C條件下進行滅菌效果驗證。

測試滅菌劑

濕熱（蒸汽）滅菌、干熱滅菌、環氧乙烷滅菌及電離輻射滅菌均需通過生物指示劑進行驗證。各類滅菌方法與其對應的標準生物指示劑如下：

在濕熱滅菌過程中，可采用經特殊化學處理的試紙條作為溫度指示手段，該試紙會在達到設定滅菌溫度時發生顏色變化。

將嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearothermophilus）的耐熱孢子，與營養培養基及化學指示劑共同處理，并干燥于試紙條上。滅菌處理后，需對試紙條進行培養以觀察孢子萌發生長情況，其顏色變化可直觀顯示滅菌效果（孢子是否被滅活）。根據規范要求，每個滅菌周期均應使用此類孢子試紙條進行驗證。

術語表

生物負載（Bioburden）：指待滅菌產品或系統中初始存活的微生物種群數量

滅菌劑（Biocide）：能夠殺滅微生物的化學或物理制劑

校準（Calibration）：通過對比測量設備與參照標準設備在特定量程內的輸出結果，驗證測量設備符合規定允差范圍的過程

致死率（Death rate）：滅菌劑使微生物種群中具有繁殖能力的細胞數量下降的速率，通過處理前、中、后期取樣并在培養基上進行活菌計數測定

D值（D value）：即十進制減少時間，指在特定溫度下使微生物數量減少90%所需的處理時間（分鐘）

微生物死亡（Microbial death）：微生物細胞在適宜繁殖條件下喪失代謝和繁殖能力的不可逆狀態

工藝驗證（Process validation）：通過文件化證據確認某工藝能達到預期效果的系統過程

無菌保證水平（Sterility Assurance Level，SAL）：經高壓滅菌器處理后材料達到10??微生物存活概率的公認標準，即滅菌物品中存在活微生物的概率低于百萬分之一

滅菌工藝（Sterilization process）：使微生物存活概率低于10??（百萬分之一）的處理過程

熱致死時間與熱化學致死時間（Thermal Death Time & Thermal-Chemical Death Time）：在特定條件下，使用熱力或熱化學滅菌劑殺滅特定微生物種群所需的時間。典型的高耐熱孢子熱致死時間值為121℃蒸汽滅菌15分鐘

參考文獻

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文章來自灰藻生物