嗜熱吸水鏈霉菌抗體檢測的臨床意義

自1932年Campbell首次報告5例“農民肺”以來，國內外學者對嗜熱放線菌與呼吸道感染的關系進行了廣泛的研究。研究團隊于1982年在洪湖縣1例農民肺死亡者家的鋪草中分離出嗜熱吸水鏈霉菌，并以分離的感染菌和其代謝產物誘導分別制成兔和鼠實驗性農民肺的動物模型。經動物實驗和臨床觀察，確認嗜熱吸水鏈霉菌H9-4可引起過敏性肺泡炎，即“農民肺”。該病在臨床診斷中有一定的困難，為此，我們探討了轉印技術在臨床早期診斷中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 菌株與培養基

嗜熱吸水鏈霉菌H9-4菌種，從湖北省洪湖地區農民肺死者鋪草中分離出，并經中國科學院鑒定。Emerson液體培養基由本室配制，葡萄糖10 g，酵母粉5 g，牛肉膏4 g，蛋白胨4 g，NaCl 2.5 g加水1000 ml，高壓蒸汽滅菌后加入過濾的微量無素(I、S、P微量元素每100 ml培養基中加入1 ml)。

1.2 待測病人血清

同濟醫院小兒科喘息性支氣管炎患兒血清122份；正常兒童血清60份；潛江總口農場哮喘病人血清78份；巴東移民正常體檢血清110份；同濟醫大職工體檢血清100份。

1.3 酶標鼠抗人IgG單抗

(軍事醫學科學院流行病研究所提供)。

1.4 實驗方法

1.4.1 制備抗原

取嗜熱吸水鏈霉菌H9-4菌種置入Emerson液體培養基中，經52°C振搖培養4天，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3次，于－30°C反復凍融5次，超聲粉碎后離心(15 000 r/min)，收集上清液濃縮即可作為抗原粗制品。

1.4.2 間接凝集試驗

用“O”型醛化紅細胞，經鞣化后載上上述裂解的H9-4 Ag，將病人血清按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128稀釋，各取0.1 ml分別加入一次性Ⅴ型聚苯乙烯塑料板的凹孔內，然后每孔加入0.1 ml H9-4 Ag致敏的診斷血細胞懸液，置震蕩器中震蕩2分鐘取出，置37°C濕盒中，2小時觀察結果。以稀釋倍數1∶32以上仍出現＋＋血球凝集視為陽性患者。

1.4.3 對流免疫電泳

將H9-4 Ag，病人血清分別加入瓊脂孔內，電泳40分鐘后取出觀察結果，以白色沉淀線清晰可見，視為陽性；若置6小時后，仍清晰可見視為強陽性。

1.4.4 免疫轉印試驗

將H9-4 Ag經SDS-PAGE(40 mA，100V)4小時電泳分離蛋白質條帶后，再轉印到硝酸纖維素膜上(50V，200 mA，8小時)。轉印好的硝酸纖維膜置4°C冰箱內備用。將待檢血清加在已轉印的硝酸纖維膜上孵育2小時，然后用PBS-吐溫洗3次，每次10分鐘，再加上酶標抗人IgG抗體(1∶200)孵育2小時，洗3次后，經顯色觀察條帶。

2 結果

結果見表1。

3 討論

3.1 從三種試驗方法比較

間接血凝試驗以及對流電泳試驗的假陽性率較高。只可以作為流行病學普查粗篩。而免疫轉印技術操作方便、方法實用，且其免疫轉印膜置4°C環境一年時間仍可使用。該法證明的73 kD多肽是嗜熱吸水鏈霉菌的主要抗原成分，該抗原的證實有助于農民肺的早期實驗診斷。

3.2 本實驗結果

提示湖北省以嗜熱吸水鏈霉菌為“農民肺”主要致病菌。值得提出的是“農民肺”的致病菌還有其他放線菌，因此其他地區尚需使用相應的菌株作為對照比較研究。