CHO細胞的穩定轉染與基因表達

1、pcDNA3.1＋-gD的線性化: pcDNA3.1＋使用說明書推薦了以下幾個酶作為線性化酶(BglⅡ MfeⅡ Bst1107Ⅰ Eam1105Ⅰ PvuⅠ ScaⅠ SspⅠ),通過DNAMAN分析gD序列發現其帶有MfeⅡ酶切位點。

2、轉染前一天,在60mm的dish中接種8×105個細胞,加入5ml培養基(含血清,不含抗生素),37℃,5%CO2培養,至轉染時要求細胞40%-80%匯合。

3、通過分光光度計 測定pcDNA3.1＋-gD的濃度,用不含血清、抗生素、蛋白質的培養基稀釋2.5ug的pcDNA3.1＋-gD至總體積150ul，其最小濃度不低于0.1ug/ul,稀釋后應顛倒幾次EP管以混勻混合物。

4、向混勻的混合物中加入15ul轉染試劑(PolyFect Transfection Reagent QIAGEN),用加樣器吹打5次。

6、在室溫下(20-25℃)孵育混合物5-10分鐘。

7、在孵育的同時，吸出dish中的培養基，用PBS液洗滌一次，加入3ml的培養基(含血清，不含抗生素)。

8、孵育完成后加入1ml培養基(含血清),用加樣器吹打2次，將產物全部加入60mm的dish中，輕輕搖動dish以混勻。

9、37℃,5%CO2培養，在細胞匯合度不超過50%時加入G418進行篩選。

轉染時轉染兩組細胞，組一在轉染后細胞匯合度不超過50%時（一般是24小時）加入G418進行篩選；組二在轉染后待細胞匯合度達到80%時1/4000、1/1000、1/300分別接種于dish中，48小時后加G418篩選。

10、加入G418后，每3天更換一次含有篩選濃度的G418。當有大量細胞死亡（5-7天）時，可以把G418的濃度減半維持篩選（此時可以加入適應性培養基1：4來改善細胞對培養基的同化作用）。

11、篩選10-14天后，可見有抗性的克隆出現，停藥培養，待其逐漸增大后，制備細胞懸液，記數，用培養基稀釋細胞到1個/10ul。在96孔板中加入培養基150ul/孔，再加入細胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉入48孔板中增殖（為了減少實驗失誤帶來的風險建議凍存部分增殖細胞）。

12、細胞大量擴增后，提取總DNA，做PCR檢測目的基因是否存在。