T細胞分離用尼龍毛柱

在研究體內及體外的免疫系統時，分離淋巴細胞群是一個關鍵步驟。因為現在市場上并沒有針對B細胞的特異性抗血清，所以分離淋巴細胞中的T細胞并不是十分方便。T細胞尼龍毛分離法利用了尼龍毛對B細胞的親和力，從而使T細胞在沒有嚴重損傷的情況下達到的足夠的純度。因為這個方法不像流式和磁珠費用昂貴，而且操作簡便，所需要的條件也不高，是一種非常實用的方法。

首先要指出的是實驗中所使用的是分離T細胞專用的尼龍毛(Nylon Fiber)，不是化工上的尼龍纖維，曾經有人問過我這種問題，如果你買錯了，可是做不出來的！

現在市面上有尼龍毛填料，也已經有了商品化的尼龍毛柱子，這兩者的區別主要是以下兩點：1.商品化的柱子的填料量是已經定好的，有一個確定的上樣量范圍。而自己買填料裝柱可以控制填料量，也就是可以控制上樣量，這對于樣本量非常少，或是樣本量非常大的實驗需求非常合適。2.商品化的柱子已經經過了無菌處理(一般是輻射滅菌)，而自己裝柱當然就要自己滅菌了。

操作方法：

1.秤取1.5g尼龍毛裝入20-30ml玻璃容器或注射器內(要可以滅菌的)，填料的體積控制在15毫升左右(注射器上有標記，所以還是比較好控制的)，因為尼龍毛的松緊關系到T細胞的回收率，所以要特別注意。注射器下端配接5厘米左右長的帶有彈簧夾的橡皮管。

2. 加入大量的PBS平衡柱子后，用鋁箔包裹，并置于適當的容器內，高壓滅菌15分鐘。

（商品化尼龍毛柱以上步驟可以省略，經過PBS平衡后可以直接進行下列步驟。）

3. 滅菌的尼龍毛柱垂直固定后放于超凈臺內，頂部以鋁箔覆蓋，避免污染。

4. 注射器下端，橡皮管，彈簧夾用無水酒精消毒。打開彈簧夾調節流速在大約3-4ml/min。

5.首先，加入3-4倍柱體的無血培養基平衡，之后加入相同體積的含有血清的培養基平衡（上述培養基都要預熱），最后等培養基液面接近柱填料液面時，關閉彈簧夾。 

6. 樣本細胞懸浮液濃度控制在約5×108cells/ml，上樣量一般是1/3-1/5柱體積。樣品加入之后，再加入少量培養液，然后關閉彈簧夾。

7.覆蓋鋁箔，垂直固定，置于消毒過的容器中，于培養箱內37℃孵育1小時。此過程中柱子必須要保持垂直狀態。

8. 從培養箱中拿出柱子，置于超凈臺內，除去鋁箔。接上按照4.中的方法消毒的彈簧夾和橡皮管，加入適當體積經37℃預熱的培養基，打開彈簧夾控制流速在3-4 mL/min，流出約5ml之后，流出的培養液基變得不透明，此時其中含有T細胞，收集這一部分培養基。 

9. 基本上何時結束收集取決于流出液體中細胞的濃度，實際上，收集的量達到一個柱體積時就可以停止收集，因為即使收集更多的量，回收率幾乎不會增加。

10 。上述操作后，細胞的 

回收率為： 15~20 ％

T細胞含量： 85~95 ％

B細胞污染率： 1 5 ％

多數細胞被確定為T細胞。

（注）收集粘附于尼龍毛上的細胞時，將T細胞收集完畢后的尼龍毛再無菌操作的狀態下取出，轉移到適當的容器中，用鑷子小心的將尼龍毛松開，粘附的細胞可以洗到培養基中。或者將注射器芯插入注射器內，通過壓力使的粘附的細胞隨著液體流出。

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