植物基因分離的定位克隆技術(shù)

定位克隆（positoinal cloning），又稱圖位克隆（map-based clonig），1986年首先由劍橋大學(xué)的Alan Coulson提出。

用該方法分離基因是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的基因座，在利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因佇到染色體的1個具體位置的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，不斷縮小候選區(qū)域進(jìn)而克隆該基因，并單明其功能和疾病的生化機(jī)制。

　　定位克隆技術(shù)主要包括以下6個步驟：

　　1.篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。利用目標(biāo)基因的近等基因系或分離群體分組分析法（BSA）進(jìn)行連鎖分析，篩選出目標(biāo)基因所在局部區(qū)域的分子標(biāo)記。

　　2.構(gòu)建并篩選含有大插入片段的基因組文庫。常用的載體有柯斯質(zhì)粒（cosmid），酵母人工染色體（YAC）以及P1，BAC，PAC等幾種以細(xì)菌為寄主的載體系統(tǒng)。用與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫，得到陽性克隆。

　　3.構(gòu)建目的基因區(qū)域跨疊克隆群（contig）。以陽性克隆的末端作為探針基因組文庫，并進(jìn)行染色體步行，直到獲得具有目標(biāo)基因兩側(cè)分子標(biāo)記的大片段跨疊群。

　　4.目的基因區(qū)域的精細(xì)作圖。通過整合已有的遺傳圖譜和尋找新的分子標(biāo)記，提高目的基因區(qū)域遺傳圖譜和物理圖譜的密譜的密度。

　　5.目的基因的精細(xì)定位和染色體登陸。利用側(cè)翼分子標(biāo)記分析和混合樣品作圖精確定位目的基因。接著以目標(biāo)基因兩側(cè)的分子標(biāo)記為探針通過染色體登陸獲得含目標(biāo)基因的陽性克隆。

　　6.外顯子的分離、鑒定。陽性克隆中可能含有多個候選基因。用篩選cDNA文庫，外是子捕捉和cDNA直選法等技術(shù)找到這些候選基因，再進(jìn)行共分離，時空表達(dá)特點，同源性比較等分析確定目標(biāo)基因。當(dāng)然，最直接的證明是進(jìn)行功能互補(bǔ)實驗。