TRIZOL提取注意事項

警告: 有毒物接觸皮膚或者不慎吞服。會導致灼傷。一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗。若感不適，看醫(yī)生并尋求苯酚和其他成分(JTSRN 80100437-5000p)的正確治療方案。）  TRIZOL在室溫下能穩(wěn)定保存12個月。盡管如此，為達到最佳效果，我們建議保存在2―8°C的環(huán)境下。

一般描述：

TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標準化RNA的產(chǎn)量十分有用。

論是人、動物、植物還是細菌組織，該方法對少量的組織(50-100 mg)和細胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細胞(>107)均有較好的分離效果。TRIZOL試劑操作上的簡單性允許同時處理多個的樣品。所有的操作可以在一小時內(nèi)完成。TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA 印跡分析、斑點雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護分析和分子克隆。如果是用于PCR，當兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時，建議用級聯(lián)擴大的DNase I(Cat. No. 18068)來處理抽提的總RNA。

RIZOL試劑能促進不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見許多介于7 kb和15 kb之間不連續(xù)的高分子量條帶，（mRNA和hnRNA成分）兩條優(yōu)勢核糖體RNA條帶位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之間 (tRNA, 5S)。當抽提的RNA用TE稀釋時其A260/A280比值≥1.8

預防RNA酶污染:

提RNA過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難完全抑制，預防其污染是十分必要的。

在實際的操作中應遵循以下指南：

* 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習慣預防微生物污染。

* 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶A 或 T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含RNA酶。

* 在TRIZOL中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。其他注意事項

* 當TRIZOL用量少于2-ml時建議使用清潔的一次性的聚丙材質試管。

* 當TRIZOL用量較大時，可以使用玻璃試管(Corex)或聚丙材質試管，事先檢驗以確保該試管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的離心力。不可使用有裂縫或者破損的試管。

* 離心前小心平衡試管。

* 離心前玻璃管口必須蓋上鋁箔并用石蠟膜封口，聚丙烯管必須蓋緊。

RNA抽提指南

注意：用TRIZOL抽提RNA時要戴手套和護眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學通風櫥完成操作。避免呼吸道吸入。

如無例外，所有的操作應該在15 -30°C的條件下完成，試劑亦在15 -30°C的條件下。