Northern Blotting反應

北方雜合反應的步驟主要包括：

（1） 加入核酸探針，使與固定于尼龍膜上的特定RNA 進行雜合反應；

（2） 待雜合反應結束后以含鹽緩沖液與SDS 洗掉非專一性結合于尼龍膜上的核酸探針。 進行反應時應注意下列幾個問題：

a. 實驗操作過程仍應盡可能避免RNase 的污染；

b. 反應前應先進行雜合前置反應（prehybridization），以便減少核酸探針與尼龍膜的間的非專一性結合反應；

c. 如果所使用的核酸探針是以random priming 或PCR 等方法所制備的雙股DNA 探針，使用前務必先加熱變性；

d. 選用適當的嚴苛度 （stringency） 進行雜合反應及后續的轉印膜漂洗工作，以便增強雜合反應訊息，并減少噪聲，這主要可以從溫度與鹽濃度兩個方面加以考量。

儀器用具：Crosslinker （Stratalinker 1800, Stratagene）；塑料盒；平端鑷子；封口機；42℃恒溫槽；60℃恒溫槽

藥品試劑：6×SSC （0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate）尼龍膜；Hybridization solution [formamide, 50% （v/v）； 5×SSC; blocking reagent, 2% （w/v）；N-lauroylsarcosine, 0.1% （w/v）； SDS, 0.02% （w/v）]3MM 濾紙；2×SSC, 0.1% SDS;0.1×SSC, 0.1% SDS

方法步驟：

1） RNA 轉印步驟結束后，移除電泳膠上的吸水紙與3M 濾紙。

2） 把尼龍膜連同電泳膠一齊移置于干凈衛生紙上，并請小心維持電泳膠與尼龍膜的相對位置。

3） 以防水筆在尼龍膜上標出電泳膠樣本孔的位置，并以剪刀剪掉尼龍膜左上角，以便標記電泳膠的左右方位。

4） 小心地拉開尼龍膜，將的放置于6×SSC （20 mL） 浸泡5 min.

5） 以平端鑷子夾起尼龍膜，待6×SSC 滴干的后，把尼龍膜平放于衛生紙上，風干至少30 min.與電泳膠接觸的那一面應朝上。

6） 以Stratalinker 1800 進行uv 連結反應。

7） 雜合前置反應：

a） 將10 mL 雜合溶液注入一個塑料袋。

b） 把已經風干的尼龍膜移置于塑料袋內，小心地把氣泡移除的后，以封口機密封好，再移至42℃恒溫槽進行雜合前置反應1~2 h.