支原體的檢測實(shí)驗(yàn)-熒光染色法
原理
熒光顯微鏡檢查法，熒光染料用 Hoechst 33258，它是一種能與DNA 特異結(jié)合的熒光染料。支原體內(nèi)含有DNA，能著色，是現(xiàn)有檢測法中最方便和最有效的一種。
材料與儀器
細(xì)胞
Hanks 醋酸甲醇 蒸餾水
蓋片 顯微鏡
步驟
1. 標(biāo)本
蓋片培養(yǎng)細(xì)胞匯合前從瓶中取出（如細(xì)胞已完全匯合，能影響對支原體的觀察）；
2. 漂洗
將細(xì)胞蓋片置于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗；如為細(xì)胞懸液則先離心去上清營養(yǎng)液后，再加入Hanks液漂洗；
3. 固定
用醋酸甲醇（1：3）固定10 分鐘；
4. 漂洗
用生理鹽水或去離子水漂洗，處理方法同2；
5. 染色
置于33258（用不含酚紅的Hanks 或生理鹽水配制，濃度為50 μg/ml）中染色10 分鐘；
6. 漂洗
置于蒸餾水漂洗1～2 分鐘，處理方法同2；
7. 觀察
從蒸餾水中取出細(xì)胞蓋片，令細(xì)胞面向上，滴pH5.5 的磷酸緩沖液數(shù)滴，覆以24×36 mm2大蓋片，置熒光顯微鏡下觀察；如用細(xì)胞懸液則先離心，去上清蒸餾水，加3~5 滴上述磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細(xì)胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，覆以蓋片后觀察。熒光顯微鏡下可見支原體呈亮綠色小點(diǎn)，散在細(xì)胞周圍，或附于細(xì)胞表面。
