從樣品制備到結果分析，磷酸化蛋白WB全流程

蛋白質磷酸化修飾是信號轉導的核心機制，其研究對解析生命奧秘與疾病機理至關重要。但 Western Blot 檢測磷酸化蛋白，卻因目標蛋白低豐度、易降解、動態變化的特性，成為科研界公認的 “噩夢級操作”—— 條帶弱、無條帶、高背景、雜帶多等問題頻發，任何環節的微小失誤都可能讓實驗前功盡棄。想要攻克這一難題，從樣品制備到結果分析的全流程精細化優化必不可少。

樣品制備：筑牢檢測根基，從源頭規避失效風險

磷酸化蛋白檢測的核心痛點集中在低豐度與易去磷酸化，而樣品質量直接決定實驗成敗，新鮮度與處理規范性是不可妥協的前提。樣品制備需堅守快、冷、準三大核心原則，三者缺一不可。

快是指細胞裂解時需迅速加入預冷的裂解液，且裂解液必須現用現配，其中蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑缺一不可 —— 前者抑制蛋白降解，后者阻斷磷酸基團脫落，若檢測酪氨酸位點磷酸化，還需額外添加 1μM 正礬酸鈉強化保護。冷則要求所有試劑、耗材提前 4℃預冷，離心機調至 4℃，全程冰上操作，組織樣品研磨需用液氮預冷研缽，細胞樣品超聲破碎也需在冰浴中進行，35-40% 功率下 3 次破碎，每次 1-2 秒、間隔 5-10 秒，避免溫度升高導致修飾丟失。準體現在刺激條件的精準把控，不同靶點的藥物濃度、處理時間差異顯著，需通過文獻查閱或預實驗確定，刺激不足會導致信號微弱，過度刺激則可能觸發負反饋機制，反而降低檢測效率，如 10ng/mL EGF 處理 Hela 細胞，10-20 分鐘為最佳刺激窗口，超過 30 分鐘則幾乎檢測不到條帶。

此外，實驗前需通過 UniProtKB、Phospho SitePlus 等數據庫，明確目標蛋白的磷酸化位點與表達水平，為抗體選擇與實驗設計提供依據。樣品濃度測定后，加入上樣緩沖液分裝凍存于 - 80℃，避免反復凍融造成磷酸基團降解。

抗體選擇：特異性為核心，靈敏度是關鍵

抗體的選擇直接決定檢測結果的可靠性，特異性不足或靈敏度不夠，后續操作再規范也難以挽回。磷酸化抗體與非磷酸化抗體的識別特性存在本質差異：非磷酸化抗體可能交叉識別磷酸化與非磷酸化蛋白，部分則僅識別非磷酸化形式；而磷酸化抗體的核心價值在于僅識別磷酸化蛋白，其位點特異性是檢測精準度的核心保障。

選擇磷酸化抗體時，需先通過文獻確認目標蛋白的關鍵磷酸化位點，優先選擇針對特異位點的抗體。同時必須仔細研讀說明書，不同生產商的抗體在操作要求上可能存在差異，盲目照搬通用流程易導致實驗失敗。以 Phospho-EGFR（Tyr1068）抗體為例，經 10ng/mL EGF 處理 30 分鐘的血清饑餓 Hela 細胞，能呈現清晰條帶，未處理細胞則無特異性信號，這正是位點特異性的直接體現。

考慮到磷酸化蛋白僅占總蛋白的 1%-10%，部分場景下占比更低，高靈敏度抗體成為弱信號檢測的關鍵。抗體稀釋倍數需謹慎優化，同一抗體在 1:2000、1:20000、1:200000 的稀釋比例下，條帶清晰度差異顯著，過高稀釋會導致信號丟失，過低則可能增加背景干擾，需結合預實驗確定最優比例。

內參設置：雙保險加持，精準校準磷酸化水平

磷酸化蛋白 WB 的內參設置絕非可有可無，單一內參難以排除實驗干擾，雙內參體系才能實現磷酸化水平的精準評估。

第一重保險是目標蛋白對應的總蛋白。檢測磷酸化蛋白時，必須同步檢測其總蛋白，只有當磷酸化蛋白與總蛋白的比值發生變化，才能確鑿證明磷酸化水平的改變。這一設置能有效排除轉錄水平波動、蛋白質合成與降解差異等非磷酸化相關因素的干擾，精準定位磷酸化修飾在特定生理過程中的作用。

第二重保險是常規內參抗體，如 GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 等。這類內參的核心作用是對實驗體系進行標準化校準，排查上樣量不均、轉膜效率差異等操作層面的誤差，確保結果的可靠性。以 Phospho-HER2（Tyr1221,1222）抗體檢測為例，經 200ng/mL EGF 處理 10 分鐘的細胞呈現清晰條帶，未處理組無信號，雙內參的同步檢測進一步驗證了該結果的真實性。

實驗操作：細節決定靈敏度，規范流程少踩坑

樣品與抗體的準備到位后，實驗操作的細節把控直接影響信號質量，每一步都需嚴格遵循磷酸化蛋白的檢測特性。

封閉環節需摒棄脫脂奶粉，優先選擇 5% BSA 封閉液。脫脂奶粉中含有的酪氨酸可能與磷酸化抗體非特異性結合，直接導致高背景問題。封閉時間以 1 小時為宜，過長會掩蓋抗原表位，造成信號丟失，過短則封閉不充分，同樣引發背景干擾。

轉膜推薦采用濕轉法，恒流 250mA 條件下轉膜 90 分鐘，確保磷酸化蛋白完全轉移至膜上。膜的選擇優先 PVDF 膜，使用前需用甲醇激活 10 秒，增強蛋白結合能力。轉膜時的 “三明治” 組裝需按濾紙 - 膠 - 膜 - 濾紙的順序進行，全程避免氣泡殘留，否則會導致局部信號缺失。

抗體孵育需摒棄 “速戰速決” 的思路，磷酸化抗體建議 4℃孵育過夜，12-16 小時的充足時間能保證抗體與抗原充分結合，且低溫環境可維持蛋白在膜上的穩定性，避免脫落。二抗則在室溫下孵育 1 小時，搖床保持 60rpm 低速，防止背景彌散。

洗脫步驟需平衡信號保留與背景去除，建議用 PBST 洗滌 3 次，每次 5 分鐘，搖床轉速逐步從 80rpm 提升至 120rpm。適度保留微弱背景信號遠比過度洗滌導致的 “白板” 更有價值，為后續結果分析預留空間。

結果分析：精準排查異常，進階技術放大信號

實驗結束后，面對異常結果無需盲目重復，精準定位問題根源并針對性解決，才能高效推進研究。

條帶弱或無條帶是最常見的問題，核心原因多為抑制劑失效或樣品刺激不充分。解決思路是確保抑制劑現用現配，重新優化刺激條件，或選用說明書推薦的陽性對照樣品，驗證實驗體系的有效性。高背景、雜帶多則大概率與封閉液選擇不當相關，更換 5% BSA 或無蛋白封閉液可有效改善。條帶彌散多由蛋白降解導致，需提高裂解液中蛋白酶抑制劑濃度，強化全程低溫操作。膜污染多因操作不當，全程使用無塵手套，用鈍頭鑷子夾取膜可避免此類問題。

為進一步提升檢測效果，可采用進階技術放大信號。IP-WB 聯用通過免疫沉淀對目標蛋白進行濃縮，能有效富集低豐度磷酸化蛋白，顯著提高檢測靈敏度。熒光 WB 尤其是雙色檢測法，可同時孵育 Cy3 標記的磷酸化蛋白抗體與 Cy5 標記的總蛋白抗體，實現同步檢測，結果更精準。此外，用 TBST 替代 PBS 作為緩沖液，可減少非特異性條帶，若中間步驟使用了 PBS，需在加入檢測底物前用大量 TBST 清洗，去除過量磷酸鈉。