人超敏C反應(yīng)蛋白(HS-CRP)ELISA試劑盒的應(yīng)用
一、背景
人超敏C反應(yīng)蛋白(HS-CRP)ELISA試劑盒用于測定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）的含量。
實驗原理：試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平。用純化的抗超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入人超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP),再與HRP標(biāo)記的超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)濃度。
二、操作步驟
1、實驗準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，恢復(fù)至室溫。濃縮洗滌液用超純水或蒸餾水稀釋20倍，待用。
2、加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加洗滌液100μl（不加DON抗體）.余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品50μl，然后再加入DON抗體50μl。注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)30分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
3、棄去孔內(nèi)液體，甩干，用洗滌液洗板4次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
4、每孔加酶標(biāo)二抗100μl，37℃，30分鐘。
5、溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板4次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
6、依序每孔加顯色液100μl，37℃避光顯色（10分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。
7、依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8、用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
三、應(yīng)用
用于老年維持性血液透析（MHD）患者穿透素3（PTX3）與超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）及營養(yǎng)不良的關(guān)系的研究：
通過檢測老年MHD患者PTX3活性,進一步探討老年MHD患者PTX3與微炎癥及營養(yǎng)不良的關(guān)系,從而為防治老年MHD患者的營養(yǎng)不良和微炎癥提供新的方法。
方法：
1、研究對象:共納入經(jīng)MHD治療3個月以上,尿素清除指數(shù)（effective urea clearnance time/volume,Kt/V）>1.2的患者共81例,根據(jù)年齡分為2組,其中老年組（年齡≥60歲）MHD患者61例,非老年組（年齡<60歲）MHD患者20例。原發(fā)病:慢性腎炎31例,高血壓腎病24例,糖尿病腎病16例,缺血性腎病1例,多囊腎1例,病因不明8例。同期于健康志愿者18例測取PTX3的醫(yī)學(xué)參考值范圍。
2、收集入選者一般資料:包括年齡、性別、透析齡、原發(fā)病、近期是否有感染。
3、監(jiān)測項目及參數(shù)測定:測量血肌酐（serum creatinine,Scr）、血清白蛋白（albumin,Alb）、血紅蛋白（hemoglobin,HB）等指標(biāo),采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定PTX3,采用免疫透射比濁法測定hs-CRP,≥3mg/L為存在微炎癥狀態(tài)。采用單室模型Kt/V值做為評價所有入選的MHD患者透析充分性的指標(biāo)。主觀綜合營養(yǎng)評估（subjective global assessment,SGA）根據(jù)包括體重、飲食等多個方面測量:分為良好（SGA1）、輕中度營養(yǎng)不良（SGA2）、重度營養(yǎng)不良（SGA3）。
4、統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用相關(guān)統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料應(yīng)用x2檢驗。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,成組比較應(yīng)用t檢驗。相關(guān)分析應(yīng)用Pearson或Spearman直線相關(guān)及偏相關(guān),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果：
1、一般情況比較:共納入81例患者,其中男性41例,女性40例,平均年齡為65.80±15.21歲（23-91歲）。其中MHD老年組男性（30人,49.18%）與MHD非老年組男性（11人,55.0%）所占比例、老年組Kt/V（1.39±0.14）與非老年組Kt/V（1.35±0.11）、老年組HB（107.02±16.65 g/L）與非老年組（107.85±14.39 g/L）、老年組透析齡（45.85±29.05月）與非老年組（51.35±27.37月）統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異,P>0.05。
2、炎癥相關(guān)數(shù)據(jù)比較:老年MHD組的PTX3（3.09±1.19 OD450）及hs-CRP（5.52±3.09 mg/L）明顯高于非老年組的PTX3（2.24±0.90OD450）及hs-CRP（4.01±2.19 mg/L）,P<0.05。
3、營養(yǎng)相關(guān)數(shù)據(jù)比較:老年組營養(yǎng)不良42例（68.85%）,顯著高于非老年組營養(yǎng)不良9例（45.0%）,P<0.05。老年組Scr（707.31±267.82 mmol/L）、Alb（37.27±4.53 g/L）明顯低于非老年組Scr（997.80±137.88 mmol/L）、Alb（41.92±2.77 g/L）,P<0.05。
4、相關(guān)性比較:老年組PTX3與hs-CRP呈正相關(guān)（r=0.524,P<0.05）,與SGA呈正相關(guān)（r=0.417,P<0.05）,與Alb呈負(fù)相關(guān)（r=-0.479,P<0.05）,與scr無明顯相關(guān)性（r=-0.134,p>0.05）。控制性別年齡BMI值行偏相關(guān):老年組PTX3與hs-CRP呈正相關(guān)（r=0.532,P<0.05）,與SGA呈正相關(guān)（r=0.401,P<0.05）,與Alb呈負(fù)相關(guān)（r=-0.492,P<0.05）,與scr無明顯相關(guān)性（r=-0.208,p>0.05）。
5、血清hs-CRP水平和PTX3對老年MHD組患者存在營養(yǎng)不良的預(yù)測:采用hs-CRP預(yù)測老年MHD患者營養(yǎng)不良與SGA評價結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）,提示檢測hs-crp水平與sga評價效果不同。ptx3預(yù)測老年mhd患者存在的營養(yǎng)不良與sga評價結(jié)果比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）,提示PTX3評價營養(yǎng)不良與SGA方法評價效果一致。
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