細胞培養注意事項

1.實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70 %ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作臺面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

2.無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。

3.小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4.工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應避免引起aerosol之產生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5.定期檢測下列項目：

(1)CO2 鋼瓶之CO2壓力。
(2)CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。
(3)無菌操作臺內之airflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000小時/HEPA)。

6.水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

7.關于工作濃度的胰酶是不是應保存在－20度？如果放在4度冰箱可以保存多久？是不是幾個小時就會失去活性？

平時放在-20度，分裝在50毫升螺口管，用時拿一管放4度用。

8.認真按照操作規程進行實驗，一般不大會導致污染，很多情況下是由于所用的試劑或培養基有污染而使實驗失敗，

9.粉末培養基配制好后(加了血清)，一般在4度盡量不要超過1個月，如在-20度存放時間可長一些，但最好也不要超過3-4個月，可能對于永生化細胞株來說要求不是太高，但我在過去的4年里一直是作原代細胞培養的，細胞嬌弱，經驗表明放置時間不宜過長。

10.關于實驗用品的清洗與消毒，我的經驗是：用過的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少許清洗劑，以超聲波洗滌30min左右，(如無超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈)，撈出晾干，再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過夜)后，自來水清洗10-15遍，雙蒸水清洗3-4遍，晾干，高壓消毒后即可使用。

許多塑料制品也可以高壓消毒，例如培養瓶蓋，膠塞，吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了，當然如果money有限，如進口的培養板、皿等，也可以重復使用1-2次，我當時使用方法是將其完全清潔后，使用前在紫外燈下敞開照射1-1.5h即可，我做過多次，沒有出現問題。塑料培養瓶由于清洗消毒不便，最好不要重復使用，如一定要重復用，可用環氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用) 。

在光鏡下，上皮細胞通常呈“鋪路石”樣排布，細胞之間有拉絲現象(即距離較遠的細胞可以通過細長的觸手相連)，細胞有成片生長的特性。而間質細胞通常呈梭形，沒有有成片生長的特性，細胞之間的聯系不緊密。但是細胞的形態特征會因為生長條件的改變而改變，如HeLa細胞是上皮細胞，但是在酸性培養條件下會變為梭形。

上皮細胞之間都有特征性的緊密連接(橋粒)結構，因此可以通過觀察培養細胞的超微結構來判斷細胞的類型，如果有緊密連接，就必然是上皮細胞。這是一錘定音的證據。注意不要把細胞消化下來做電鏡，要用細胞刮刮下來后做電鏡。 此外每一種上皮細胞都有其特征的細胞角蛋白的表達(cytokertin，CK)，可以查一下子宮內膜腺上皮細胞表達的CK分子，然后進行免疫細胞化學的鑒定。

細胞在偏堿的情況下培養，耐受能力會逐漸下降，可能是產生脫壁現象的原因，后來我重新測了一下培養基，為7.5左右，我用滅菌的HCL調了一下，培養基顏色變成淡紅透亮，再次培養，發現細胞貼壁比較好了，搏動效果也不錯，因此，我以后每次培養前都要重新調好PH值，我覺得很多因素是能影響PH值的。

血清質量不好，影響了細胞生長。所以，我認為以后養細胞，用的血清濃度最好是每批次血清都摸一下，不一定要以參考文獻為準，畢竟國產的血清質量差異比較大啊。

細胞無菌操作是關鍵，對于配制培養液時，有些人為了讓培養粉充分溶解，攪拌4小時或更長時間。其實這完全沒有必要，一般培養基的固體組分還是易溶于水的，攪拌的時間長了會增加污染機會，雖然后來濾過除菌了，但細菌的代謝產物比如脂多糖誰能夠把它濾掉？細菌的代謝是很快的，甚至在常溫下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的經驗就是攪拌30min-60min就把它過濾。

另外關于培養基的pH問題，一般按照說明書操作，加入所說的NaHCO3量，與預計的pH不會有什么距離，也就是說基本上不用調pH，如果相差大，要考慮三蒸水的質量是否有所下降，當然這時調pH也是不得已而為之。我配培養基時基本上不調pH，只是用試紙檢測一下pH，觀察一下培養基的顏色。

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