磷酸鈣轉(zhuǎn)染法

材料：
質(zhì)粒DNA指數(shù)生長的真核細胞
2 M CaCl2
2×HBS （pH 7.05）
配方:
2×HBS （pH7.05）：900 ml 超純水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214g，Glucose 2.4 g 和HEPES 10 g，調(diào)pH 至7.05，定容至1 升，過濾（0.2 μm 濾膜）后儲存于4℃?zhèn)溆谩?/span>
方法：
1. 細胞分盤： 通過胰酶消化收集細胞，用適當?shù)耐耆囵B(yǎng)基以1×105 至4×105細胞/cm2 的密度平鋪細胞于60 mm 組織培養(yǎng)皿上（根據(jù)實驗需要選擇培養(yǎng)皿，使細胞貼壁后所占面積達到培養(yǎng)皿總面積的40－70％）。將細胞置于含5％CO2 的37℃溫箱中孵育8-24 h,當細胞貼壁完全后即可開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h 換液（用4 ml 新鮮的完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基）。
注：為得到較高的轉(zhuǎn)染效率，盡量使用指數(shù)生長的細胞，轉(zhuǎn)染時細胞的密度不超過80％。
2. 制備磷酸鈣－DNA 沉淀：以60 mm 組織培養(yǎng)皿用500 μl 反應總體積為例。在滅菌水中加入質(zhì)粒DNA（總量4－10 μg 為佳），再加入31 μl 2 M CaCl2，使三者總體積達到250 μl，混勻。將等體積2×HBS 鹽溶液逐滴加入，同時輕彈管壁，使每滴加入后及時混勻。靜置2 min 后，立即將這500 μl 的磷酸鈣－DNA懸液逐滴加入上述單層細胞的細胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動平皿混勻。
注：可以觀察到滴入的部位培養(yǎng)基瞬間會出現(xiàn)渾濁的橘黃色，應盡快將其混勻，避免形成過大的顆粒，影響轉(zhuǎn)染效率。
3．若轉(zhuǎn)染的細胞不用轉(zhuǎn)染促進劑處理，則置于含5％ CO2 的37℃溫箱孵育。8 h
后吸去培養(yǎng)基與DNA 沉淀，加入5 ml 37℃預熱的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)將細胞放置溫箱孵育，16-40 h 觀察其轉(zhuǎn)染效率。
參考：分子克隆實驗指南第三版（p1284～1285）