用流式測細胞周期的一點總結

【細胞種類】小牛肺動脈平滑肌細胞第5代；
【培養液】含15％FBS的MEM液；
【固定方法】70％酒精固定；
【染色方法】PI單染法；
【具體步驟】
1、接種： 以10*5/ml密度（活細胞）接種，加培養液；
2、同步化： 24h后加不含FBS的MEM進行同步化12－24h；
3、加因素： 棄MEM液換等量的培養液，加藥物等因素培養到指定時間；
4、消化： 用不含EDTA的0.25％胰酶進行消化，離心（2000轉5min）；
5、洗滌： 用PBS液洗一邊，棄上液；
6、固定： 向10ml試管內加2.5ml鹽水G溶液（配置方法見司徒鎮強《細胞培養》）重新懸浮細胞，然后緩慢加入－20度預冷的95％酒精7.5ml，冰浴30min；（可以過夜，第二天染色）
7、PI單染法： 吹散細胞后用300目尼龍濾膜過濾，然后離心，去上液；加100ul 5mg/ml RNA酶溶液，37度保溫30min，然后冰浴終止酶作用；加PI染液（100ug/ml）閉光染色30min；
8、FCM測細胞周期。

【注意點】
1、同步化是為了各單個細胞處于相對的同一周期內，即“饑餓療法”，目前雖有爭議，但這一步是不可或缺的。
2、對于PI單染還是雙染好，目前也是意見不一，本實驗采用單染法。
3、300目尼龍濾膜過濾是為了減少聚在一起的細胞團，防治堵塞流式儀。