食品微生物檢驗(yàn)GB4789.3-2016大腸菌群計(jì)數(shù)及注意事項(xiàng)
一、大腸菌群定義和衛(wèi)生學(xué)意義
大腸菌群定義：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名，它不代表某一種或某一屬的細(xì)菌，而是一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。這群細(xì)菌包括：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬（又叫產(chǎn)氣桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌）和等。
衛(wèi)生學(xué)意義：大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌評(píng)價(jià)樣品中是否受到糞便的污染。表示了對人體健康是否具有潛在的危險(xiǎn)性。直接反映了樣品受糞便污染的的程度。
二、GB4789.3-2016大腸菌群MPN法
1. 什么是MPN法？
?MPN法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。
?MPN值并不能表示實(shí)際菌落數(shù)， 實(shí)際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點(diǎn)，MPN值是落在這個(gè)置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點(diǎn)。
?靈敏度較高，適用于污染菌落較少的樣品。
2. 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)操作
3. 培養(yǎng)基原理解析
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）
?月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長，胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。
?36±1℃培養(yǎng)24h后若已產(chǎn)氣，則可停止培養(yǎng)。如果沒有觀察到有產(chǎn)氣的現(xiàn)象，則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h。
?如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯。- +
煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）
?膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽性菌生長。
?培養(yǎng)基配方當(dāng)中含有膽鹽，大腸菌群發(fā)酵乳糖所產(chǎn)的酸會(huì)與膽鹽發(fā)生反應(yīng)，形成膽酸沉淀。培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色。
4. 大腸菌群最大可能數(shù)（MPN）報(bào)告
?確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù)，檢索MPN表，報(bào)告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。
?當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在MPN表中無法查找到MPN值時(shí)，如：陽性管數(shù)為122，123，232，233等時(shí)，建議增加稀釋度（可做4~5個(gè)稀釋度），使樣品最高稀釋度能達(dá)到陰性終點(diǎn)(如果污染程度不能判定，則多加一稀釋度），然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進(jìn)行查找，最終確定MPN值。
三、GB4789.3-2016大腸菌群計(jì)數(shù)平板法
1. 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法流程圖
2. 培養(yǎng)基原理解析
結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
?配方中膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌，中性紅作為指示劑，在酸性條件下為紫紅色。
?大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)的酸與膽鹽結(jié)合，可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環(huán)。
?該培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。
3. 計(jì)數(shù)典型和可疑菌落數(shù)
結(jié)果判讀：選取菌落數(shù)在15 CFU～150 CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm或更大。
證實(shí)試驗(yàn)：從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10 個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。
4. 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告
?經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落,挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管,證實(shí)有6個(gè)陽性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。
?若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。
四、質(zhì)量控制
1. 實(shí)驗(yàn)室過程中，每批樣品稀釋液都要做空白對照。
2. 為了控制環(huán)境污染，每次檢驗(yàn)過程中，于檢驗(yàn)臺(tái)上打開兩塊計(jì)數(shù)瓊脂平板，并在檢驗(yàn)環(huán)境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，以掌握檢驗(yàn)過程中是否存在來自檢驗(yàn)環(huán)境的污染。
3. 定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應(yīng)定量活菌參考品，在P2實(shí)驗(yàn)室或陽性對照實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M(jìn)行陽性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并進(jìn)行記錄，次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)至少每2個(gè)月進(jìn)行1次。
五、大腸菌群測試片法
1. 原理：大腸菌群檢測片由輕便防水紙質(zhì)材料做支撐，其上覆蓋干燥培養(yǎng)基層（營養(yǎng)物質(zhì)、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑）和透明隔水膜組成，經(jīng)輻照滅菌。可用于食品、飲料等的大腸菌群計(jì)數(shù)。含有四氮唑指示劑菌落為紅色，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和產(chǎn)氣。
2. 特點(diǎn)優(yōu)勢
?菌落計(jì)數(shù)特別方便（容易判讀），紅色菌落，易于食品顆粒分開，無菌落重疊現(xiàn)象；
?菌落分布特別均勻；
?避免了培養(yǎng)基對細(xì)菌熱損傷有關(guān)；
?菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生
?經(jīng)濟(jì)環(huán)保 無粉塵，體積小，重量輕，易儲(chǔ)運(yùn)
?保質(zhì)期長干制無水培養(yǎng)基，性質(zhì)穩(wěn)定，保質(zhì)期更長
六、所需培養(yǎng)基試劑和質(zhì)控菌株
用途 | 名稱 |
樣品稀釋 | 生理鹽水 |
磷酸鹽緩沖液（PBS） | |
磷酸鹽緩沖液（PBS） | |
磷酸鹽緩沖液（PBS） | |
生理鹽水 | |
MPN法計(jì)數(shù)初發(fā)酵試驗(yàn) | 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） |
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST) | |
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） | |
雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯 | |
平板計(jì)數(shù) | 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） |
結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） | |
結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板 | |
MPN法復(fù)發(fā)酵和平板計(jì)數(shù)證實(shí) | 煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） |
煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB) | |
煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） | |
HANDYPLAT微生物測試片 | 大腸菌群測試片 |
Q-Strain定量質(zhì)控菌株 | 大腸埃希氏（ATCC25922） |
大腸埃希氏菌（ATCC25922） |
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