EB病毒誘導淋巴細胞永生化實驗方法

實驗步驟：
1.  EB病毒液的制備
?  復蘇B95.8細胞株，使用培養基為10% FCS RPMI-1640
?  逐步添加培養基至細胞長至對數生長期
?  細胞計數，調節細胞數量為1×106個/ml
?  在CO2培養箱中繼續續培養10天，中間不換液
?  至第10天收集培養上清，1800rpm，4℃離心15分鐘
?  0.22μm濾器過濾，1ml/支分裝，凍存于液氮備用

2.  病人外周血液的采集、分離
?  使用枸櫞酸鈉抗凝管采集恢復期病人外周血10ml，盡量在24h內進行分離
?  平衡鹽(BSS, balanced salt solution)溶液配制(請具體參見淋巴細胞分離液使用說明)：
Solution A
Anhydrous D-glucose 0.1 percent 1.0 g/l
CaCl2 × 2H2O 5.0 × 10-5 M 0.0074 g/l
MgCl2 × 6H2O 9.8 × 10-4 M 0.1992 g/l
KCl 5.4 × 10-3 M 0.4026 g/l
TRIS 0.145 M 17.565 g/l
Dissolve in approximately 950 ml distilled water and add
10 N HCl until pH is 7.6 before adjusting the volume to 1 litre.
Solution B
NaCl 0.14 M 8.19 g/l
*To prepare the BSS mix 1 volume SolutionA with 9 volumes solution B. Prepare the solution fresh each week. Other standard salt solutions may be used.
①  取病人外周血4ml+4mlBSS，混勻
②  各取4ml緩慢加入含有3ml淋巴細胞分離液Ficoll PLUS-Paque（GE Healthcare Bio-Sciences貨號:71716700,使用前，充分混勻）的10ml離心管中（分兩管進行）
③  400g，18℃，離心30min
④  小心吸取上層血漿，保存備用，避免擾動細胞。
⑤  小心吸取淋巴細胞層至新的15ml離心管中
⑥  加入6mlBSS，以吸管輕輕重懸細胞
⑦  100g，18℃，離心10min，棄上清
⑧  以8mlBSS再次洗滌一遍，離心，棄上清（重懸同時進行細胞計數）
(一般1ml血能分離出1×10^6個細胞，故4ml血約有4×10^6個細胞)

3.  EB病毒轉化淋巴細胞
①  取EBV上清1ml重懸上述細胞，37℃水浴，2h，20min晃動一次
②  加入3ml 20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A （環孢素A Sigma Product No. C1832 ）
③  分兩孔，2ml/孔加至24孔板中（如果分離的血量大，請酌情考慮加入25cm2培養瓶中培養），37℃，5％CO2培養
④  一般24h后即可見到細胞聚集成團生長，3-5天可見液體PH值發生變化，呈橙黃色，早期視情況補液，待細胞生長良好再采用半量換液（培養基為3ml 20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A）
⑤  一般15天左右即可建立穩定生長的淋巴母細胞。