組織和細胞RNA的制備：異硫氰酸胍法

（一）試劑準備

1. CSB緩沖液：42mM檸檬酸鈉；0.83% N-lauryl sarcosine（十二烷基，N甲基甘氨酸鈉）；0.2 mM β-巰基乙醇。

2. 變性液：異硫氰酸胍（終濃度 4 M）25g、CSB緩沖液 33ml,混合直至完全溶解，可在65℃助溶。4℃保存備用。

3. 2 M乙酸鈉：pH 4.0。

4. 異丙醇

5. 無水乙醇、70%乙醇

6. 酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）

7. DEPC H2O:100ml ddH2O中，加入DEPC 0.1ml,棄分振蕩，37℃孵育過夜。15磅高壓滅茵，4℃保存備用。

（二）操作步驟

1. 樣品處理：

（1）培養細胞：收集細胞1-2×107，離心，500g×5min。對于貼壁培養細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重懸細胞并轉移至10ml離心管中；懸浮培養細胞可直接轉移離心管；離心：500g×5min；PBS洗滌2次。棄上清，置冰浴。加預冷變性液2 ml，充分搖動，使細胞裂解完全。以下操作均在冰浴中進行。

（2）組織：取1-2g組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置組織勻漿器中，加入預冷的變性液12ml，在冰浴中充分勻漿。

2. 加2 M乙酸鈉（pH 4.0）0.2ml，混合后將溶液轉移至5ml離心管中。

3. 加酚：氯仿：異戊醇2.2ml，顛倒混合用力振蕩10s，冰上放置10min。

4. 4℃離心，12000g×20min。

5. 小心吸取上層含有RNA的水相，并轉移至一新的5ml離心管中。避免吸取兩相之間的蛋白物質。

6. 加等體積的異丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。

7. 4℃離心，12000g×15min。

8. 棄上清，再加變性液2ml重懸RNA沉淀物，振蕩直至RNA完全溶解（必要時可65℃水浴促溶）。

9. 加入等體積異丙醇，置-20℃ 30min。

10. 4℃離心，12000g×15min。

11. 棄上清，加入70%乙醇4ml洗滌RNA沉淀。4℃離心，8000g×5min。

12. 棄上清，將沉淀晾干。

13. 加入適量DEPC H2O溶液解RNA（65℃促溶10-15min）。

（三）注意事項：

1. 所有實驗過程均須避免Rnase的污染。

2. 要避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。