RNA的定量和完整性分析

RNA的完整性可以通過瓊脂糖變性電泳分析檢測,而含量則通過紫外分光光度計確定。常見的變性電泳有甲醛變性電泳，戊二醛變性電泳等。

甲醛變性電泳檢測RNA完整性

一、材料、試劑和儀器

1 材料: 植物總RNA 5-10μg

2 試劑:

1）加樣運載緩沖液（Loading buffer），50% 甘油，1mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.25%溴酚藍，25%二甲苯氰FF

2）10×TAE Buffer

3）5×甲醛凝膠電泳緩沖液：，0.1mol/L MOPs (pH7.0)，40mmol/L乙酸鈉，5mmol/L DETA(pH8.0)

4）甲醛, 甲酰胺

3 儀器: 電泳裝置，紫外透射觀測儀

二、實驗程序

1 甲醛變性的瓊脂糖(Agarose) 凝膠的配制

在250mL的錐形瓶中準確稱量2g Agarose （Sigama），再加20mL 10×TAE Buffer，144mLDEPC處理過的雙蒸水，微波爐中化膠，待冷卻至50-60℃加EB至終濃度≤0.5μg/mL。在通風櫥中加入36 mL甲醛，放置一段時間以減少甲醛蒸汽。

2 RNA的甲醛變性電泳

1） 樣品制備，RNA總量10μg，5×甲醛凝膠電泳緩沖液4μl，甲醛 3.5μl，甲酰胺10μl，加入無菌離心管中混合，95℃水浴變性2min(或55℃,15min)，取出后放入冰中冷卻。

2） 加入2μl無菌的DEPC處理的加樣運載液。(使用加樣運載液的目的有三: 增大樣品密度, 以確保DNA均勻進入樣品孔內; 使樣品呈現顏色, 便于加樣操作; 能明確顯現樣品在電泳膠上的泳動位置. 以 0.5 X TBE作電泳液時, 溴苯酚在瓊脂糖中的泳動速率與長 300 bp 的雙鏈線狀DNA相同 , 而二甲苯氰FF 的泳動速率與長 4kb 的雙鏈線狀DNA相同)

3）將膠板浸沒在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中，點樣前5V/cm預跑5min。點

樣后3-4V/cm電泳。

4）電泳結束后（溴苯酚藍遷移到約8cm處），紫外燈下觀察, 照相。