MIRNA(microRNA)檢測實驗流程(加polyA法)

一：概述

microRNA(miRNA)是一類有大約22個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中。miRNA在個體發育的不同時期及不同組織中有不同的表達模式，都表明了其在發育和分化中起有重大的調控作用。迄今為此，對miRNA的檢測方法主要有Northern Blot 等基于分子雜交的方法，這些方法敏感度低、耗時長、RNA的用量較大。miRNA qPCR Detection Kit采用了國際上公認的核酸檢測標準技術――Real-Time PCR技術來對miRNA進行檢測，其具有快速、特異性強、靈敏度高等優點。

以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit來對miRNA進行檢測的實驗操作流程：

二：背景資料

檢測人腦組織中miRNA的表達。所選的miRNA及其擴增長度信息如下：

三：實驗內容

RNA抽提、RNA 加“PolyA”處理、RNA反轉錄、定量PCR檢測及其數據分析。

四：實驗主要儀器和試劑

主要實驗儀器:冷凍離心機、常規PCR儀、分光光度計、電泳系統 iQ5 Real Time PCR Detection System。

主要實驗試劑:TRIzol（Invitrogen）、RNA級氯仿、冷凍異丙醇及冷凍的75%乙醇、DEPC滅菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA電泳緩沖液、miRNA qPCR Detection Kit。

五：實驗操作

前期準備:為避免RNase 對RNA的降解及其提高實驗的精確性，在實驗前請準備好用DEPC處理過的離心管及其移液槍頭，同時實驗操作時，需戴口罩及其一次性手套。所有實驗操作盡可能在冰上進行Total RNA抽提。

1、樣品處理:取50mg～200mg樣品直接在液氮中研磨至粉末，再轉移一定量至含1mLTRIzol的離心管中，反復振蕩裂解組織細胞。（Note：如為貼壁細胞，去培養基后可直接加入TRIzol(5~10×107細胞數加約為1mLTRIzol)，反復吹打裂解細胞，再收集TRIzol至離心管中；如為懸浮細胞，離心收集懸浮細胞，加入TRIzol(5~10×107細胞數加約為1mLTRIzol)反復吹打裂解細胞）。

2、相分離:室溫放置上述樣品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿為200μL，蓋上蓋子，劇烈振蕩約1min，室溫靜置5min，然后12000g 冷凍離心15min（4℃），小心取出樣品，通過觀察可以發現樣品分三層，其中最上層含有RNA樣品。

3、RNA沉淀:小心吸取上清液約450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷凍異丙醇的新離心管中，混勻，12000g 冷凍離心10min（4℃）。

4、RNA洗滌:去上清，加入500μL 冷凍的75％乙醇，彈起沉淀后 12000g 冷凍離心5min（4℃），去上清，再稍離，吸去上清液。

5、RNA溶解:風干約5～10min（注意不能風太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水約30μL。貼上標簽后-80℃保存。

6、RNA濃度測定:吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀釋10倍后，在分光光度計Nanodrop上測定RNA濃度，以DEPC水做空白對照，同時記錄RNA濃度及其OD260/OD280。Note：如為常規的分光光度計，注意比色杯測定時的最少所需體積量，取一定量的RNA，用DEPC水稀釋約100倍左右，同時在紫外條件下測定OD260和OD280，再按照公式計算RNA濃度＝40ng/μL×OD260×稀釋倍數）。

7、RNA電泳檢測：

7.1 變性膠制備：取1.2g Agarose + 75mL去離子水煮沸，冷卻至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒膠至寬口梳子的膠板上，蓋上蓋子。

7.2 電泳緩沖液配制(1×Mops)：取50mL10×Mops ，用去離子水稀釋至500mL，倒入電泳槽中。

7.3 RNA樣品處理：取RNA樣品約3μL，最后補充DEPC水至15μL，65℃變性10min后立即冷卻，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可電泳。

7.4 RNA電泳：先把RNA膠放入電泳槽中，100V作用電泳約5min，再在點樣孔中點入處理過的RNA樣品，100V左右電泳至溴酚藍至膠的1/3處，取膠拍照。