肝中RNA的分離與鑒定

原理

細(xì)胞內(nèi)的核酸多以核蛋白的形式存在，其中脫氧核糖核蛋白主要存在于細(xì)胞核中，核糖核蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。這兩類核蛋白在0.14mol／L氯化鈉溶液中的溶解度相差很大。核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度、脫氧核糖核蛋白的溶解度卻相當(dāng)?shù)汀?/span>

制成肝勻漿后，用0.14mol／L氯化鈉溶液抽提，可將兩種核蛋白分離。分離過程中加入少量檸檬酸鈉，可抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的水解作用。

在含有核糖核蛋白的0.14mol／L氯化鈉溶液中，調(diào)節(jié)pH至4.2，使其達(dá)到等點(diǎn)電，核糖核蛋白即從溶液中沉淀出；用熱的10％氯化鈉溶液抽提核糖核酸，最后用冷乙醇將核糖核酸鈉析出，而獲得純化的RNA。

DNA和RNA在波長260nm處有很高的吸收峰值，蛋白質(zhì)則在280nm處有很高的吸收峰值。利用這個原理，我們測定純化樣品在260nm和280nm處的吸光度，可以推算出樣品中RNA的濃度，并判斷其純度。

用標(biāo)準(zhǔn)樣品測得在波長260nm處，1μg/ml RNA鈉鹽吸光度為0.025，（光程為1cm），即A260＝1時，樣品中RNA濃度為40 μg/ml。純凈的RNA樣品A260/A280的比值約為2.0，樣品中含有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)，會使A260/A280的比值下降。A260/A280的比值大于1.8基本能達(dá)到各種后繼實驗的要求。

操作

1．肝勻漿制備：新鮮兔肝，用0.9％NaCl洗去血液，除去結(jié)締組織，剪碎，稱取4g肝組織，加4m1 0.14mol/L NaCl溶液，勻漿器中研磨，制成肝勻漿。

2．分離核蛋白：肝勻漿倒入試管中，4000rpm離心5min，上清倒入另一試管中為A管。沉淀加2m1 0.14mol／L NaCl攪勻后再置勻漿器中研磨，4000rpm離心5min，上清倒入A管，沉淀重復(fù)上述操作，上清并入A管，沉淀棄去。

3．A管用10％乙酸調(diào)pH至4.2，混勻，靜置5min，4000rpm離心5min，傾去上清，沉淀含核糖核蛋白。

4．A管沉淀中加3m1 10％NaCl，攪勻，100℃水浴10min(不斷攪拌，防沸溢出)，冷卻， 4000rpm離心5min，留上清液。

5．A管上清液加95％冷乙醇5ml，見乳白色核糖核酸鈉沉淀，混勻放置10min，4000rpm離心15min，沉淀為純化RNA。

6．RNA的溶解：沉淀中加入0.1 mol/L NaOH 4.0ml，攪拌溶解，2000rpm離心10min，上清液則為RNA水解液。

7．RNA的測定：用0.1mol/L NaOH 將樣品稀釋到一定濃度，以0.1mol/L NaOH 調(diào)零，測定樣品的A260和A280，計算出每克肝組織中的RNA含量，并判斷純化RNA的純度。

注意事項

1. 在制備肝勻漿時，應(yīng)盡量在冰冷條件下進(jìn)行。

2. 各步驟操作應(yīng)力求準(zhǔn)確，盡量減少中途核酸的丟失，保證定量測定的準(zhǔn)確性。

3. 稀釋后應(yīng)該盡量使樣品A260和A280處于0.1-0.7的范圍內(nèi)。

儀器

玻璃勻漿器
離心機(jī)
UV9100紫外可見分光光度計
試管
刻度吸管

試劑
1. 0.9％氯化鈉溶液。
2. 10％氯化鈉溶液。
3. 0.14mol／L氯化鈉溶液(含0.01 mol／L檸檬酸鈉)：稱取氯化鈉 8.182g和檸檬酸鈉-2H2O 2.941g，用蒸餾水溶解并稀釋至1000m1。
4. 10％乙酸溶液。
5. 95％乙醇溶液(冷藏)
6. 0.1mol/L NaOH