利用Trizol法提取植物乳桿菌總RNA

一、實(shí)驗(yàn)原理

Trizol的主要成分是苯酚，苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的核酸物質(zhì)得到釋放。同時(shí)苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。

0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。

β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。利用Trizol試劑處理的樣品加入氯仿后，經(jīng)離心樣品分成水樣層、中間層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中，收集水樣層后可以通過異丙醇沉淀RNA。

二、實(shí)驗(yàn)試劑

Trizol試劑，DEPC，氯仿，異丙醇，DEPC處理水，75%的乙醇（DEPC水配制），植物乳桿菌05-19

三、實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫培養(yǎng)箱，常溫離心機(jī)，低溫離心機(jī)，移液器，電泳儀，電泳槽，紫外分析儀

四、操作步驟

接植物乳桿菌于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜備用。

取菌液2 ml，12000 rpm離心2分鐘，棄上清，加入1 ml Trizol 試劑 ，用槍吹吸，懸浮菌體，室溫放置十分鐘。

加入200 ul氯仿，蓋緊 離心管 ，用手劇烈震蕩15秒，4 ℃12000 rpm離心十分鐘。

取上清（大約500 ul），加入等體積異丙醇，-20 ℃放置十分鐘，4 ℃ 12000 rpm離心十分鐘。

棄去上清，加入1 ml 75%乙醇，混勻，4 ℃ 12000 rpm離心五分鐘。

小心棄去上清液，室溫干燥5-10 min，注意不要過分干燥，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶解到15 ul的DEPC處理水中。

進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將剩余RNA保存于-70 ℃。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

整個(gè)操作要帶一次性口罩及手套，并盡可能低溫下操作。

加入氯仿后，首先混合均勻，吸取上清時(shí)，注意不要吸入中間層及有機(jī)相。

使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染

配制溶液應(yīng)使用無RNase 的水。