細菌計數：揭秘細菌界的“人口普查”
細菌計數板
最簡單的細菌計數方法是直接通過顯微鏡計數，計數板中央區域雕刻成不同大小的方格。在顯微鏡下直接統計已知體積內的細菌數量，再根據計數的方格數和計數室的總體積，換算成每毫升樣品中的細菌總濃度。
網格體積為0.008立方毫米，即0.000008mL。若正方形內有10個細菌，細菌密度為10個細菌/0.000008 mL，相當于1250000個細菌/ mL。必須計數多個小方格中的單元格并取平均值以獲得可靠的測量。
熒光染色計數
使用計數板并不一定能準確計數活細菌數量，因為在顯微鏡下并不總能區分活細菌、死亡細菌和同等大小的碎屑。此時，能夠區分存活和死亡的細菌的熒光染色技術就顯得尤為重要。熒光染色技術是基于細菌膜完整性的雙染色法，其原理是SYTO 9（或類似綠色熒光核酸染料，如N01、MLgreen）能自由滲透所有細菌的細菌膜，與細菌的DNA結合后發出綠色熒光。因此，它能標記所有細菌（無論活死）。丙啶碘（PI）（紅色熒光核酸染料）無法穿過完整的活細菌細菌膜，只能進入細菌膜受損的死細菌，與DNA結合后發出紅色熒光。當PI進入死細菌時，它會猝滅SYTO 9的綠色熒光，使死細菌主要顯示紅色。因此，活細菌發出綠色熒光是因為它們只吸收綠色染料，而死細菌則呈現紅色，因為紅色染色劑取代了綠色染色劑在核酸上的染色效果。
細菌計數器
細菌計數器的原理是將電極浸入電解質溶液中，負極懸掛在玻璃管內，正極位于玻璃管外部。小孔兩側電極施加恒定電流，形成電阻回路。無顆粒通過時，電流穩定，電阻恒定。當一個細菌（非導電顆粒）通過小孔時，它取代等體積的導電電解質，導致小孔電阻瞬間增大。電阻變化產生電壓脈沖：脈沖高度（幅度）正比于細菌體積，脈沖數量等于細菌個數。這種方法在一定濃度范圍內快速且準確；但是，如果培養液濃度過高，可能會有多個細菌同時通過小孔，從而導致結果偏差。
平板計數
平板計數是對活細菌數量的計數。原理是活細菌在適合的培養條件下培養時會繁殖并形成可見的菌落。結果通常以每毫升菌落形成單位（CFU/mL）表示，而不是每毫升細菌數，因為多個細菌可能落在同一位置形成一個菌落。此外，以簇狀或鏈狀生長的細菌樣本難以分散，一個菌落可能代表多個細菌，因此，平板上的菌落數一般比實際活細菌數量低一些。盡管存在這些局限性，但該方法仍然非常實用，因為它提供了活細菌數量的估算值。
在進行傾注平板法或涂布平板法之前，對培養物進行梯度稀釋是重要的第一步。梯度稀釋的目的是獲得 CFU 數量在 30-300 范圍內的平板，該過程通常涉及以10的倍數進行多次稀釋，以簡化計算。梯度稀釋的次數根據對培養物密度的初步估計來確定。平板計數通常統計含有30-300個菌落的平板。菌落數量過少（<30）的樣本無法獲得具有統計學意義的可靠數據，而菌落數量過多（>300）的平板則難以準確計數單個菌落。此外，在此范圍內計數可以最大限度地減少多個細菌細菌形成單個菌落的情況。因此，計算出的 CFU 值更接近群體中活細菌的真實數量。
傾注平板法
將稀釋后的樣品（一般1mL）與熔化的瓊脂培養基混合，倒入無菌平皿中，細菌在培養基中生長形成可見菌落，每個菌落理論上源于一個活細菌細菌。通過計數菌落數并乘以稀釋倍數，即可計算原樣品中的細菌濃度。該方法特別適用于計數需氧菌和兼性厭氧菌，因為菌落可生長在培養基表面和內部。
細菌濃度（CFU/mL）= 平皿平均菌落數*稀釋倍數/取樣體積（通常為1mL）。例如：稀釋度（10^6）菌落數150，則樣品濃度= 150×10^6 = 1.5×10^8 CFU/mL。
平板涂布法
平板涂布法的原理是將稀釋后的樣品均勻涂布在已凝固的瓊脂培養基表面，細菌在需氧環境中生長形成可見菌落。通過計數表面菌落數并乘以稀釋倍數，即可計算原樣品中的細菌濃度。該方法特別適用于好氧菌計數，因為所有菌落均生長在表面，便于觀察和進一步分離純化。
細菌濃度（CFU/mL） = 平皿平均菌落數*稀釋倍數/取樣體積（若取0.1 mL，則*10）。例如：某稀釋度（10^5）平板菌落數為80（取樣0.1 mL），則原樣品濃度 = 80×10^5×10 = 8×10^7 CFU/mL。
膜過濾法
一些樣品微生物濃度極低無法采用上述任何一種平板計數方法，此時，原始樣本必須在涂布前進行濃縮而非稀釋。膜過濾法（也稱薄膜過濾法）是一種高靈敏度的微生物計數技術，特別適用于細菌濃度較低的樣品（如飲用水、純化水、飲料、制藥用水等）。原理是將一定體積的樣品通過孔徑為0.22 μm的微孔濾膜，細菌被截留在濾膜表面，然后將濾膜置于適宜的瓊脂培養基上培養，細菌生長形成可見菌落。通過計數菌落數并除以過濾體積，即可計算原樣品中的細菌濃度（CFU/mL）。該方法能檢測極低濃度的活細菌，常用于大腸菌群、菌落總數和特定致病菌的測定。
MPN法
最可能數（MPN）法原理基于稀釋極限法將樣品系列稀釋接種到多個含選擇性培養基的試管中，培養后觀察陽性反應（如產酸產氣），通過陽性管組合模式查表或計算得出最可能的細菌密度。該方法不直接計數菌落，而是通過概率統計估算，特別適用于低濃度、濁度高或含抑制物的樣品（如水、食品）。
含有酚紅乳糖的培養基可以用于檢測飲用水中的大腸菌群。酚紅作為指示劑，pH 7.4±0.2時呈紅色，酸性pH時變為黃色。大腸菌發酵乳糖并產生酸性產物。因此，當它們存在于飲用水中時，酚紅乳糖湯會變黃。培養后，每個稀釋步驟應記錄陽性試管數量。在上方圖中，陽性（黃色）管的排列為：5-2-0，按照下方的表格查詢意味著平均約有49個細菌存在于100毫升原始水樣中。
吸光值法
除了直接計數細菌的方法外，還有一些基于間接檢測細菌密度的方法也常用于估算和比較培養物中的細菌密度。最常用的方法是使用分光光度計測量液體懸浮液中細菌樣本的吸光度。在分光光度計中，光束穿過細菌懸浮液，穿過懸浮液的光由檢測器測量，穿過樣本到達檢測器的光量被轉換為透光率百分比或稱為吸光度。隨著懸浮液中細菌數量的增加，吸光度也隨之增加。通過對具有不同吸光度值的培養物樣本進行活菌平板計數，將吸光度與實際細菌數量關聯起來。利用這些值，可以繪制吸光度與細菌密度之間的校準曲線。
干重法
測量培養樣本的干重是另一種間接評估培養密度的方法，無需直接測量細菌計數。用于稱重的細菌懸浮液必須通過過濾或離心濃縮，洗凈后再干燥，然后進行測量。干燥程度必須標準化，以考慮殘余水分含量。該方法對絲狀微生物尤其有用，因為它們難以通過直接或可行的板計數進行計數。
結語
細菌計數方法多種多樣，從簡單的直接顯微計數到精密的電子計數儀，從經典的平板計數到適用于低濃度樣品的膜過濾法和MPN法，再到便捷的間接吸光度法與干重法，每一種技術都在不同場景中發揮著不可替代的作用。直接方法能提供總細菌數或活細菌數的精確估算，而間接方法則以其快速、簡便的特點廣泛應用于日常監測和過程控制。
