人整合素α2β1(ITG α2β1)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）
本試劑僅供研究使用
目的：本試劑盒用于測(cè)定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中 整合素α2β1(ITG α2β1) 的 含量。
實(shí)驗(yàn)原理 ：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定 標(biāo)本 中 人 整合素α2β1(ITG α2β1) 水平。用純化的 整合素α2β1(ITG α2β1) 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入 整合素α 2β1(ITG α2β1) ， 再與HRP標(biāo)記的 整合素α 2β1(ITG α2β1) 抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物 ，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后 加 底物TMB顯色。TMB在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 整合素α 2β1(ITG α2β1) 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）， 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算樣品 中人 整合素α 2β1(ITG α2β1) 濃度。
試劑盒組成 ：
試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片（ 48 ） | 2片（ 96 ） | |
密封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | |
酶標(biāo)包被板 | 1 ×48 | 1 ×96 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品： 900 μ g/L | 0.5ml× 1 瓶 | 0.5ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 1.5ml× 1 瓶 | 1.5ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
酶標(biāo)試劑 | 3 ml× 1 瓶 | 6 ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
樣品稀釋液 | 3 ml× 1 瓶 | 6 ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑A 液 | 3 ml× 1 瓶 | 6 ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑B 液 | 3 ml× 1 瓶 | 6 ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3ml× 1 瓶 | 6ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
濃縮洗滌液 | （20ml × 20 倍）× 1 瓶 | （20ml × 30 倍）× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
樣本處理及要求 ：
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬(wàn) /ml 左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持 2-8 ℃的溫度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可 將標(biāo)本放于 -20 ℃保存，但 應(yīng) 避免反復(fù)凍融 .
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品 ，因NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（ HRP ）活性。
操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10 孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品 100 μ l，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50 μ l，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取 100 μ l分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50 μ l，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50 μ l棄掉，再各取 50 μ l分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50ul ，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50 μ l分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50 μ l，混勻后從第七、第八孔中分別取 50 μ l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50 μ l，混勻后從第九第十孔中各取 50 μ l棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50 μ l，濃度分別為 600 μ g/L ，400 μ g/L ，200 μ g/L ，100 μ g/L ，50 μ g/L）。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、 待測(cè)樣品孔 。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μ l，然后再加待測(cè)樣品 10 μ l（樣品最終稀釋度為 5 倍）。 加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁， 輕輕 晃動(dòng) 混勻 。
3. 溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育3 0 分鐘 。
4. 配液：將30 （ 48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 （ 48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體， 甩干 ，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μ l，空白孔除外 。
7. 溫育：操作同3 。
8. 洗滌：操作同5 。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50 μ l，再加入顯色劑 B50 μ l，輕輕震蕩混勻， 37 ℃避光顯色15分鐘.
10. 終止：每孔加終止 液50μl ，終止反應(yīng) （此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色） 。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零， 4 50 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的 吸光 度（OD 值） 。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng)：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液 可能 會(huì)有 結(jié)晶 析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶 ，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后 乘以 總稀釋倍數(shù)（ ×n×5 ）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請(qǐng)避光保存。
7． 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
計(jì)算 ：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以 稀釋
倍數(shù) ；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值
代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以 稀釋
倍數(shù) ，即為樣品的實(shí)際濃度。
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