骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞總結(jié)
2003年8月，為給大家提供一個(gè)網(wǎng)上交流干細(xì)胞研究經(jīng)驗(yàn)的平臺(tái)，我們干細(xì)胞版設(shè)立了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)討論區(qū)，經(jīng)過近三個(gè)月的討論學(xué)習(xí)，我們既學(xué)習(xí)豐富了自己的知識(shí)體系，也對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞尤其是分離培養(yǎng)方面有了更為詳實(shí)的認(rèn)識(shí)，為了大家閱讀的方便，我們決定把本版中的相關(guān)內(nèi)容，同時(shí)參考部分書目和文獻(xiàn)，做一總結(jié)。
一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離
目前常用的分離MSC的方法有全骨髓法和密度梯度離心法，全骨髓法即根據(jù)干細(xì)胞貼壁特性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化MSC的目的。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，提取單核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。隨著對(duì)MSC表面抗原認(rèn)識(shí)的深入，有人利用免疫方法如流式細(xì)胞儀法、免疫磁珠法等對(duì)其進(jìn)行分離純化，但經(jīng)過流式或磁珠分選后的細(xì)胞出現(xiàn)了增殖緩慢等一些問題，加之耗費(fèi)較大和技術(shù)的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。
1. 直接培養(yǎng)法（全骨髓培養(yǎng)法）
1987年，F(xiàn)riedenstein等發(fā)現(xiàn)在塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的貼壁的骨髓單個(gè)核細(xì)胞在一定條件下可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞，而且這些細(xì)胞擴(kuò)增20－30代后仍能保持其多向分化潛能，這類細(xì)胞即為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC），其工作對(duì)今后MSC的研究具有重要意義，不僅證實(shí)了骨髓MSC的存在，而且創(chuàng)建了一種體外分離和培養(yǎng)MSC的簡(jiǎn)便可行的方法，得到了廣泛的應(yīng)用。
culture-spirit采用直接貼壁法，24-36小時(shí)首次換液，換液時(shí)用PBS洗兩次，7-10天傳第一代，以后2-3天傳代。培養(yǎng)基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（頂級(jí)），得到了較好的培養(yǎng)結(jié)果。
布蘭卡根據(jù)自己培養(yǎng)大鼠MSC的經(jīng)驗(yàn)，詳細(xì)介紹了實(shí)驗(yàn)步驟：
（1）接種后60-80分鐘,換液去除懸浮細(xì)胞
（2）原代培養(yǎng)24 h,48 h各換液一次
（3）觀察細(xì)胞情況，在原代培養(yǎng)7天左右時(shí)，如觀察到成片的典型形態(tài)的細(xì)胞，在瓶底用Marker筆標(biāo)記，0.25%胰酶消化，鏡下觀察控制，約5-10分鐘（室溫太低時(shí)應(yīng)放置到孵箱中），加入全培養(yǎng)基終止消化，瓶體朝上，吸管輕輕吹打4-8分鐘，尤其是標(biāo)記部位。不要用力吹打，以免把貼壁較牢的成纖維細(xì)胞，上皮樣細(xì)胞吹打下來。
（4）傳代到新瓶中，加入少量培養(yǎng)基，孵箱靜置20-30分鐘后，MSC大多牢固貼壁。瓶底朝上，輕輕吹打，丟棄懸浮以及貼壁不牢的細(xì)胞（大多是上皮樣細(xì)胞），加入全培養(yǎng)基開始傳代培養(yǎng)，如觀察仍有較多雜細(xì)胞，可重復(fù)上述步驟。
（5）經(jīng)上述處理后，原代的那瓶細(xì)胞仍有一些MSC生長(zhǎng)，可繼續(xù)按原代培養(yǎng)，如觀察到MSC的克隆，仍可按上述步驟純化處理。
（6）原代或傳代的細(xì)胞如觀察的少量成片的雜細(xì)胞，可直接鏡下瓶底標(biāo)記后，超凈臺(tái)里用長(zhǎng)吸管尖端機(jī)械刮除，吸出去掉。
菊花與刀用的是全骨髓培養(yǎng)法，直接用含10%的FBS培養(yǎng)基沖洗大鼠的股骨和脛骨，為了避免沖起許多氣泡應(yīng)緩慢沖，沖的次數(shù)不應(yīng)太多。沖洗后不用離心直接接種在培養(yǎng)瓶里，48 h~72 h后首次換液，一般7~10天可傳代。
天之餃子介紹的小鼠MSC的分離方法：取6 w小鼠的股骨和脛骨，直接用含培養(yǎng)基沖出骨髓，一定要盡量把干垢端的骨髓沖干凈。沖洗后不離心直接接種在培養(yǎng)瓶里，24－48 h后去懸浮，再接下來的每3－4天換液一次，直到需要傳代。
2. 密度梯度離心法
裴雪濤等用比重為1.073 g/ml的percoll分離（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面處細(xì)胞層，離心后洗滌以2×105/cm2的密度接種，72 h后更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液一次。細(xì)胞長(zhǎng)到80％匯合時(shí)1：1傳代。
菊花與刀利用PERCOLL密度1.073分離大鼠MSC 時(shí)，用2400 rpm×20 mins后可見中間有一層約1～2 mm厚的白色層，仔細(xì)用吸管吸取這一層再用PBS離心2遍即可加培養(yǎng)基和胎牛血清培養(yǎng)即rMSCs。
周進(jìn)明等利用密度為1.082的percoll分離小鼠MSCs，500g×30min離心后，取中間的單個(gè)核細(xì)胞層，PBS洗兩次，接種于IMDM培養(yǎng)基，1 d后換液，去掉非貼壁細(xì)胞，以后每3-4天換液。
jetter用過FICOLL,FERCOLL,上海二分廠的淋巴細(xì)胞分離液分離MSC細(xì)胞效果都不錯(cuò)，當(dāng)然所獲細(xì)胞群的純度不一，Percoll最純，而上海二分廠的淋巴細(xì)胞分離液所獲細(xì)胞群的傳代能力優(yōu)秀（35 PASSAGE）。
本版的部分園友認(rèn)為MSC貼壁培養(yǎng)得到的細(xì)胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分離得到的細(xì)胞較為均一，多能分化性和增殖力不如貼壁培養(yǎng)的，尤其是增殖力相差很遠(yuǎn)，有人添加bFGF或/和表皮生長(zhǎng)因子發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)增殖能力。
二、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)
天之餃子認(rèn)為，間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)一定要用塑料培養(yǎng)瓶，不能用玻璃的。因?yàn)橄箝g質(zhì)干這類的基質(zhì)細(xì)胞不易貼玻璃，而且現(xiàn)在買的進(jìn)口好品牌的培養(yǎng)瓶都涂有一層促細(xì)胞貼壁的物質(zhì)，多數(shù)園友培養(yǎng)時(shí)都添加10－15％胎牛血清。
分離培養(yǎng)結(jié)果的差異可能是由于各個(gè)研究小組標(biāo)本來源、采用的分離方法不同從而所獲得的細(xì)胞不同，或者用來檢測(cè)的細(xì)胞代數(shù)不同，或者培養(yǎng)過程中用的胎牛血清不同，導(dǎo)致MSCs獲得或失去這些表面標(biāo)記物的表達(dá)。
三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性
體外培養(yǎng)的MSC體積小，成梭形，核漿比大。不表達(dá)分化相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)志，如I、II、III型膠原、堿性磷酸酶或Osteopontin；也不表達(dá)SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多種表面蛋白，這群細(xì)胞特性穩(wěn)定，擴(kuò)增一代和兩代后的細(xì)胞同質(zhì)性分別達(dá)到95％和98％。MSC聯(lián)系傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍能具有多向分化潛能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自發(fā)分化，在體外特定的誘導(dǎo)條件下，MSC可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉、神經(jīng)等多種細(xì)胞。
四、其他相關(guān)內(nèi)容
Jiang將從成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分離的間充質(zhì)干細(xì)胞（CD45－TER119－）命名為多潛能成年祖細(xì)胞，他們證明，MAPC高表達(dá)端粒酶，而且隨著細(xì)胞的擴(kuò)增，端粒的長(zhǎng)度不變，單個(gè)MAPC來源的細(xì)胞群不僅能在體外向3個(gè)胚層的細(xì)胞分化，而且能在體內(nèi)能夠向各種組織細(xì)胞分化，相比較而言，形態(tài)與MSC相似的體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞則不具有類似的分化潛能。
參考文獻(xiàn)
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中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志.2002,22(3).-167-169 培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其移植后在體內(nèi)的定位分布
Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem Cells
NATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow
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