RNA的提取和cDNA合成原理和實(shí)驗(yàn)方法(3)

第一節(jié) 植物病毒RNA 提取

大多植物病毒RNA 為單鏈RNA ，并且其極性與mRNA 極性相同，植物病毒RNA 提取較為簡(jiǎn)單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結(jié)果。

一、材料

提純TMV病毒液（10mg/ml）。

二、設(shè)備

冷凍臺(tái)式離心機(jī)，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑

TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無(wú)RNA 酶的雙菌水。

四、操作步驟

1、取一eppendorf管加入提純TMV（10mg/ml)400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4℃下12000g離心10分鐘。

2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機(jī)相交界面無(wú)蛋白為止。

3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數(shù)十秒，4℃下12000g離心10分鐘。

4、取水相，加入1/10倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。

5、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。

6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無(wú)RNA 酶的雙菌水或TE緩沖液中。

7、取10ml進(jìn)行電泳分析，另10ml用于cDNA合成。

[注意]

1、整個(gè)操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。

2、由于病毒RNA 鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍?，一般需要多次進(jìn)行酚/氯仿的抽提。