RNA原位核酸雜交方法
一、基本原理
是指運用寡核苷酸等探針檢測細胞和組織的RNA表達的一種原位雜交技術。其基本原理是：在細胞或組織結構保持不變的條件下，用標記的已知RNA核苷酸片段，近核酸雜交中堿基配對原則，與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合（雜交），所形成的雜交體經顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內相應的Mrna、rRNA 和tRNA分子。
RNA原位雜交不同于DNA原位雜交主要有：
（1）使用的探針不同：RNA原位雜交中多采用RNA或寡核苷酸探針，特異性更強。
（2）檢測的目的不同：RNA原位雜交檢測和分析的主要為內源性基因，包括細胞內固有基因、異常基因和變異基因。DNA原位雜交主要為外源性基因檢測。
（3）有較高的靈敏度：在檢出細胞和組織內在低拷貝核苷酸時，RNA原位雜交能獲得較好定位。
二、RNA原位雜交中的探針
1. 探針的種類
RNA探針是指帶有標記的能與組織內相對應的核苷酸序列互補結合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。根據在RNA雜交中所使用的探針依其來源可分為三種：即特異性cDNA、cRNA探針和人工合成寡核苷酸探針。
2. 探針的標記
根據標記物可分為同位素標記和非同位素標記。非同位素標記技術目前有生物素，地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶和熒光素。
三、地高辛標記的核酸探針進行石蠟切片的RNA原位雜交
組織的前處理：
1. 冰凍切片的制備：離體后組織立即取材，1.5 cm×1.2 cm×0.2 cm，放入4%多聚甲醛溶液中（PBS新配制），4℃，固定2-4 h。倒去固定液后，加入30%蔗糖溶液（PBS新配制），4℃過夜，次日將組織切片，或儲存在-80℃或-140℃超低溫冰箱內。
2. 組織的固定和石蠟切片的制備：離體后組織立即取材，1.5 cm×1.2 cm×0.2 cm，放入4%多聚甲醛溶液內（PBS新配制），也可用2.5%戊二醛，在室溫下固定3-4 h。用PBS沖洗，經梯度酒精脫水、二甲苯透明和浸蠟包埋切片
操作步驟：
（1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次5分鐘；
（2） 無水乙醇浸泡2次，每次1分鐘；
（3） 95%乙醇浸泡2次，每次1分鐘；
（4） PBS清洗3分鐘；
（5） 2%焦碳酸二乙酯（DEPC）室溫下浸泡10分鐘；
（6） PBS清洗10分鐘；
（7） 滴加不含RNA酶的1 ug/ml 蛋白酶K，37℃孵育15-20分鐘；
（8） PBS清洗2次，每次3分鐘；
（9） 0.2 N 的HCl 30分鐘；
（10）PBS清洗2次，每次3分鐘；
（11）酸酐處理液振蕩洗2次，每次5分鐘；
（12）PBS清洗2次，每次5分鐘；
（13）預雜交緩沖液漂洗30分鐘；
（14）準備核酸探針混合物：使用預雜交緩沖液稀釋探針，85℃加熱5分鐘， 置于冰塊中10分鐘；
（15）雜交37-42℃過夜。
（16）將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片；
（17）PBS清洗3分鐘；
（18）含RNA酶A的NTE緩沖液37℃漂洗30分鐘；
（19）PBS清洗5分鐘；
（20）室溫，2×SSC漂洗10分鐘；
（21）37℃，1×SSC漂洗10分鐘；
（22）37℃，0.5×SSC漂洗10分鐘；
（23）37℃，Buffer A漂洗10分鐘；
（24）加入抗地高辛抗體37℃孵育3 小時；
（25）Buffer A漂洗2次，每次10分鐘；
（26）Buffer B漂洗2次，每次5分鐘；
（27）NBT/BCIP顯色，顯微鏡下進行觀察。
（28）水洗；
（29）核固紅復染，脫水封片。
試劑配制：
（1）0.2 mol/L HCl：HCl 8.2 ml，ddH2O，定容0.5 L
（2）0.1 mol/L 三乙醇胺(pH8.0)：三乙醇胺 5.33 ml，ddH2O定容0.4 L。
（3）酸酐處理液: 0.25%醋酸酐（臨用前用0.1 mol/L 三乙醇胺(pH8.0)配）。
（4）20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3 g，枸櫞酸鈉 88.2 g，ddH2O 定容1 L。
（5）100×Denhardt's：Ficoll 1 g，PVP 1 g，BSA 1 g，ddH2O 定容50 ml。
（6）雜交液：Formamide 5 ml，20×SSC 2.5 ml，Dextran sulfate 1 g，100×Denhardt's 0.5 ml，10%SDS 0.5 ml，10 g/L sperm DNA 0.1 ml，H2O 1.4 L。
（7）Buffer A（pH7.5）：100 mmol/L Tris-HCl， 150 mmol/L NaCl
（8）Buffer B （pH9.5）：100 mmol/L Tris-HCl， 100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2。
（9）Buffer C（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA。
（10）NTE緩沖液：500 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA pH8.0
（11） 預雜交緩沖液：含50%去離子甲酰胺的4×SSC
（12）NBT/BCIP液：（NBT：氯化氮四唑藍，BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二鈉鹽）
A、將10 mg NBT溶于200 ml 二甲基甲酰胺中。
B、于37℃加入1ml底物緩沖液（50 mmol/L Tris HCl PH=9.5，100 mmol/L NaCl 1 mmol/L MgCl2后，滴入）。
C、將5 mg BCIP溶于200 ml 二甲基甲酰胺中，然后慢慢加入上述溶液中，置-20℃保存。
