細胞因子的分子生物學檢測法

細胞因子基因的檢測包括對其DNA的檢測和mRNA表達水平的檢測。特定細胞因子mRNA表達水平的檢測有助于判斷細胞表達該細胞因子的水平；而細胞因子DNA的檢測可以判斷該細胞因子基因存在與否及其變異情況。常用的方法有Southern印跡、斑點印跡、PCR，原位雜交及原位PCR等，Northern印跡及RT-PCR。這里簡要介紹常見細胞因子mRNA表達水平的檢測。

一、斑點雜交法測定培養細胞IL-2 mRNA的含量

本法可用于基因組中特定基因及其表達產物的定性及半定量分析。該法先將RNA變性后直接點樣于硝酸纖維膜上，可用手工操作點樣，也可用斑點式點樣器點樣，再與特異性探針進行雜交。

由于其操作比Northern印跡簡單、迅速、所需樣品量少，且可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測，故很適合于臨床應用。亦可用于DNA的檢測。但其缺點是不能鑒定所測基因的分子量。

下面以檢測培養細胞的IL-2 mRNA含量的檢測，說明斑點雜交法的操作過程。只要改變相應的DNA探針，此方法也適用與其他細胞因子mRNA含量的檢測；或者改變RNA的提取方法，也適用于其他類型細胞的檢測。

二、原位雜交法測定TNF的mRNA

RNA-DNA原位雜交的原理與分子雜交其它方法的原理相同。但是其它方法都是將RNA提取出來后進行分子雜交，而原位雜交則是在細胞內mRNA原有位置上進行雜交，細胞則盡可能保持原有形態。

將細胞以適當方法固定后，除去脂類并適當消化細胞內的蛋白質，增大細胞對大分子物質的通透性，使DNA探針便于出入細胞。與免疫組化相結合，原位雜交可以將顯微鏡下的組織形態學資料與DNA，mRNA，蛋白質水平的基因活動聯系起來。進行分子雜交之后，將玻片上細胞置與顯微鏡下觀察，可確定不同細胞內的基因表達定位情況。

三、反轉錄PCR(RT-PCR)定量檢測細胞因子的mRNA

細胞因子的mRNA壽命短且拷貝數低，因此難以在小量樣本中進行檢測。RT-PCR是一種能檢測細胞內低豐度特異RNA的方法，其原理是首先以RNA為模板，在逆轉錄酶的催化下，合成與RNA互補的cDNA。

然后以cDNA為模板，用PCR技術對靶序列進行擴增，使微量細胞因子的RNA經放大后檢出。RT-PCR能檢出單個細胞中少于10個拷貝的特異RNA，如同時放大內參照物，即可對RT-PCR檢出的細胞因子mRNA進行定量。