基因工程載體的設計

載體設計在基因工程中占有十分重要的地位，對基因轉錄、翻譯和產(chǎn)物表達、基因工程菌培養(yǎng)和產(chǎn)物分離等都具有很重要的影響。在基因工程產(chǎn)物的研究開發(fā)中，質粒設計需要生物科學家和工程專家的緊密協(xié)作。

通過對DNA重組技術中的各種載體的分析，可以發(fā)現(xiàn)，作為DNA重組的載體，一般應具備如下條件：

①能夠進入宿主細胞；

②可以在宿主細胞中存活并獨立復制，即本身是一個復制子，或者能夠整合到宿主細胞的染色體；

③要有篩選標記，如抗生素抗性標記、營養(yǎng)缺陷型標記等，以便于篩選出重組細胞，同時在重組細胞培養(yǎng)時還能利用篩選標記以抑制不含載體細胞的生長，提高細胞培養(yǎng)和產(chǎn)物表達的效率；

④對多種限制酶有單一或較少的酶切位點，最好是單一切點，使基因操作容易進行；

⑤能容納目的基因。

目的基因至少應包括：啟動子、目的蛋白的基因序列及終止子。常見的用于大腸桿菌的啟動子列于表11.4.3。用于霉菌的啟動子有：Cbh1、glaA、gpd及alcA等。

理想的啟動子應該是受到很好調(diào)節(jié)的強啟動子，同時，宿主細胞的基底調(diào)節(jié)蛋白質產(chǎn)生水平應該是零。啟動子對誘導劑的響應要迅速、誘導劑價格低、使用安全，誘導方法不但能夠在試驗室小試中應用，還應考慮在工業(yè)規(guī)模的可行性。例如溫度誘導在小規(guī)模培養(yǎng)時較容易實現(xiàn)，但在大發(fā)酵罐中要改變溫度會產(chǎn)生嚴重的滯后、對細胞產(chǎn)生熱沖擊響應及增加蛋白水解酶的活力，就不是十分合適。另外許多化學誘導劑價格昂貴，如果殘留在產(chǎn)品中還會造成健康問題。某些啟動子需要營養(yǎng)缺陷進行誘導，存在著怎樣精確地控制誘導的問題。

與載體中啟動子相對應的是目的基因轉錄的終止子（terminator）。如果采用強啟動子，就必須有強終止子與之匹配。終止子的作用是：在目的基因被轉錄后當讀到特定的密碼子時會釋放出RNA聚合酶以結束轉錄。如果終止子不夠強，RNA聚合酶得不到及時釋放，就會造成不需要基因的轉錄，而且會干擾控制質粒拷貝數(shù)的基因單元，嚴重時還會發(fā)生質粒復制失控和細胞死亡。原則上基因密碼表中的終止密碼都能用于終止子，典型的用于E.coli的終止子有：Rho factor；T1及T2系列的轉錄終止子等。

DNA重組使用的載體可以分為三大類：①克隆載體。是以繁殖DNA片段為目的的載體；②表達載體。用于目的基因的表達；③穿梭載體。穿梭載體是一類人工構建的具有兩套復制起點和篩選標記、可以在兩類不同細胞中存活和復制的質粒載體，它們能攜帶外源DNA序列在不同物種的細胞間，特別是在原核和真核細胞間往返穿梭，一般用于真核生物DNA片段在原核生物中增殖，然后再轉入真核細胞宿主表達，如用于大腸桿菌和酵母細胞的穿梭質粒及大腸桿菌和哺乳動物細胞的穿梭質粒等。