微生物基礎操作:微生物鑒定技術
1. 前言
本文主要介紹微生物實驗室微生物鑒定的范圍,分離技術,形態如何描述、基礎生化試驗、常見的微生物鑒定系統、鑒定結果出來后如何判斷來源及建議措施等內容。
2. 定義
2.1 鑒定:借助于現有的微生物分類系統,通過特征測定,確定未知的、或新發現的、或未明確分類地位的微生物所應歸屬分類群的過程。
2.2 培養物:一定時間一定空間內微生物的細胞群或生長物。如微生物的斜面培養物、搖瓶培養物等。
3. 內容
3.1 鑒定表1范圍的微生物
表1鑒定范圍
序號 | 微生物 |
1 | A/B級出現的超標微生物 |
2 | 環境監測中超出合格限/行動限的微生物 |
3 | 無菌陽性檢出的微生物 |
5 | 微生物潔凈區年度優勢菌落 |
6 | 微生物實驗室使用的標準菌種 |
7 | 其他需要鑒定的的菌種 |
3.2.1 大多數非無菌藥品生產過程和部分無菌生產環境的風險評估中,對所檢出微生物的常規特征包括菌落形態學、細胞形態學、革蘭染色或其他染色特性,及某些能夠給出鑒定結論的關鍵生化反應(如氧化酶、過氧化氫酶)進行分析,一般即可滿足需要。
3.2.2 無菌試驗結果陽性、無菌生產模擬工藝(如培養基灌裝)失敗、環境嚴重異常事件時,對檢出的微生物鑒定至少達到種水平,必要時需達到菌株水平。
3.2.3 微生物實驗室的標準菌種使用前需要進行驗收,包括形態學描述,基礎生化試驗等,條件具備的需要鑒定到種屬。
3.3 分離技術
3.3.1 分段劃線分離法
? 當菌苔或濃的菌液多用此法進行分離。從平板表面涂抹培養物的地方開始劃線,每劃連續的一組線段后,再與上段劃線相交數次劃出下一組的連續線段,如此劃到第四或第五段,合蓋即成。如圖1所示。
圖1 平板分段劃線(左)及培養后菌落分布示意圖
3.3.2 連續劃線分離法
? 含菌量較少的菌液多用此法進行分離。從平板表面涂抹培養物的地方開始劃線,連續向整個表面左右展開并一直劃完,形成一條接種曲線。如圖2所示。
圖2 平板連續劃線法(左)及培養后菌落分布示意圖
3.3.3 注意事項
? 劃線分離用的平板應保持適宜的濕度,在表面不能有凝集水,以免細菌在接種線蔓延生長,菌落相互依聯。
3.4 菌落形態表述
3.4.1 細菌形態表述
? 菌落形態從大小、形狀(圓形、假根形、不規則形等)、隆起形狀(如擴展、苔狀、低凸、凸面、乳頭狀等),邊緣(整齊、波狀、裂葉狀、圓鋸齒狀、有緣毛等),表面狀態(光滑、皺褶、顆粒狀、龜裂狀、同心環狀等),表面光澤(閃光、不閃光、金屬光澤等),質地(油脂狀、膜狀、黏、脆等),顏色,透明程度(不透明、半透明)等方面來描述。
3.4.2 霉菌形態表述
? 生長速度:培養一定天數、測量菌落直徑,以生長極慢、慢、中等、快等說明。
? 菌落表面:平滑或有皺紋、致密或疏松,有無同心環或輻射狀溝紋。菌落全部、中心及邊緣部分分別記錄。
? 色:表面、底部和菌落背面顏色及變化。
? 菌落質地:外觀似氈狀、絨毛狀、棉絮狀、羊毛狀、束狀、粉粒狀、明膠狀或皮革狀等。
? 菌落邊緣:全緣、鋸齒、樹枝或纖毛狀。
? 菌落高度:扁平、丘狀隆起、陷役,或菌落中心部分凸起或凹路。
? 培養基顏色變化:菌落周圍有無色素擴散到培養基內。
? 滲出物:菌落表面有無帶顏色的液滴。
? 氣味:霉味、土氣味、芳香味、無味等。
3.4.3 酵母菌形態表述
? 酵母菌在玫瑰紅鈉瓊脂平板上的菌落表面濕潤、黏稠,類似細菌菌落,但多數為圓形乳白色,少數紅色,微凸、邊緣整齊,少數呈毛狀,偶有干皺型。
? 酵母菌為單細胞,無菌絲,故菌落不深入基質,與培養基結合不緊密,用接種環極易黏起菌落培養物。并在水中易分散。
? 在瓊脂內的菌落除圓形外,常有鐵餅形、三角及多角形。
3.5 基礎生化試驗
3.5.1 觸酶(過氧化氫酶)試驗
3.5.1.1 原理
? 具有過氧化氫酶的細菌培養物,加入過氧化氫試液,立即產生氣泡。
3.5.1.2 本試驗腸用于鑒別葡萄球菌、微球菌(陽性)與鏈球菌。乳酸菌及梭菌為陰性反應。
3.5.1.3 方法
? 用塑料接種環挑取菌落一環,置于潔凈載玻片上,滴加觸酶試劑數滴,立即觀察結果。如產生氣泡為陽性反應,不產生氣泡者為陰性反應。
3.5.2 氧化酶試驗
3.5.2.1 原理
? 氧化酶不直接與氧化酶試劑反應,而是首先使細胞色素c氧化,然后此氧化型細胞色素c再使對苯二胺試劑氧化,使之成為玫瑰紅色到暗紫色的醌類化合物。
3.5.2.2 本試驗主要用于奈瑟球菌屬鑒別,區別假單胞菌科與氧化酶陰性的腸桿菌科細菌。
3.5.2.3 方法
? 取潔凈的濾紙,用塑料無菌接種環挑取新鮮待檢菌的菌苔或菌落少許,涂于濾紙上,滴加氧化酶試劑,菌落立即呈現玫瑰紅色、繼而變深,并于30秒內呈現深紫色為陽性反應。不變色為陰性反應。或根據廠家說明書來進行操作。
3.5.3 注意事項
3.5.3.1 待檢菌應是純培養物,否則所觀察的生化反應可能是兩種或多種菌的混合反應,造成試驗紊亂,無法得出正確的鑒定結果。
3.5.3.2 待檢細菌最好采用18~24小時的新鮮培養物,此時細菌群體細胞的生理特征比較一致。培養時間過長或陳舊的培養物,細胞衰退,生理特征亦會發生改變,常會影響鑒定結果的準確性。
3.5.3.3 嚴格遵守觀察反應的時間,時間過短或過長,不能觀察到正確結果。
3.5.3.4 染菌的物品需要經過高壓121℃30min及以上溫度和時間的滅菌后,按照EHS要求處理。
3.6 酵母菌鑒定
? 當其外觀與細菌菌落不易區別時,可將平板置低倍顯微鏡下,觀察菌落邊緣。酵母菌菌落的邊緣由可分辨的小珠或魚卵狀酵母細胞組成。或挑取菌落少許,加水制成薄涂片、加蓋玻片,置高倍顯微鏡下觀察,可見比細菌大數倍的圓形、卵圓形并帶有芽體的酵母細胞,甚易識別。當平板內酵母菌菌落甚多時,常有酒香氣味。
? 必要時可進行基因型微生物鑒定。
3.7 霉菌鑒定
3.7.1 形態觀察
? 菌絲粗大,寬約4.0~8.0微米,無色透明或呈現各種鮮艷的顏色,有營養菌絲與繁殖菌絲之分。多數霉菌菌絲有分隔,為多細胞分枝絲狀體。菌落形態較大,質地蔬松,外觀干燥,不透明,菌落與培養基間連接緊密,不易挑取,菌落正反面,邊緣與中心的顏色、構造通常不一致,有霉味。
3.7.2 必要時可進行基因型微生物鑒定。
3.8 常見鑒定系統
3.8.1 BBL Crystal鑒定系統
是一種以熒光、顯色技術相結合的細菌鑒定系統,使用5種鑒定板條,采用30種鑒定反應,可在最短4小時內鑒定包括革蘭氏陽性菌、奈瑟/嗜血菌、厭氧菌、腸/非發酵菌在內的500多種微生物。
3.8.2 API鑒定系統
3.8.2.1 定義
法國梅里埃公司生產的基于數值分類鑒定技術,通過計算反應性狀出現的頻率來進行的一種小型的微生物鑒定系統。
3.8.2.2 API鑒定概率說明(圖3)
圖3 API鑒定概率說明
3.8.2.3 如果第一個菌名的鑒定概率>80%,則可將未知菌定為該菌名;
3.8.2.4 如果第一個菌名的鑒定概率<80%,就將前面兩個菌加在一起,還不足80,就將第三個也加在一起,若其和超過80,如果這幾個菌都是同一個“種”內的不同生物型,則可稱為鑒定到種級水平;如果這幾個菌都屬于同一個屬內,則稱為鑒定到屬級水平。
3.8.2.5 如果頭三個菌的%id之和<80,則此結果應定為不可接受的。
3.8.2.6 圖示舉例(好的鑒定結果)(圖4)
圖4好的鑒定結果
3.8.2.7 圖示舉例(可接受的鑒定結果)(圖5)
圖5可接受的鑒定結果
3.8.2.8 圖示舉例(低分辨率的鑒定結果)(圖6)
圖6低分辨率的鑒定結果
3.8.3 Vitek 2 compact全自動微生物鑒定儀
VITEK 2 COMPACT是全自動微生物系統用于鑒定細菌和酵母菌及藥敏試驗,微生物各自的新陳代謝不同,生化譜也就不同, 通過各種生化反應,包括酶的反應,酸化試驗,產堿試驗,同化試驗,抑制試驗等方法,根據顏色或濁度的變化,儀器自動判讀,達到判讀閾值時,自動處理生化譜,最終得出屬或種的鑒定結果。
3.8.4 全自動快速微生物質譜檢測系統
采用MALD-TOF技術(基質輔助激光解析電離飛行時間質譜)獲取質量圖譜并通過數據庫對其進行分析,從而完成微生物鑒定。
3.9 鑒定時常見污染菌來源及建議措施(供參考),見表2。
表2 常見污染菌來源及建議措施(供參考)
來源 | 例子 | 代表菌屬 | 建議措施 |
空氣污染 | 塵埃、皮膚屑、水滴等 | 細菌:G+菌類為主,如: 微球菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬等。 真菌:曲霉屬、青霉屬、酵母菌等。 | 控制壓差、風速、溫濕度等參數、以及過濾稀釋、規范人員更衣程序和潔凈區行為等。 |
水源污染 | 自來水、純化水、注射水等 | G-菌類,如:假單胞菌屬、產堿桿菌、寡養單胞菌屬、洋蔥伯克霍爾德菌、甲基桿菌屬等。 | 過濾除菌、無水化管理等。 |
原料污染 | 糖、膠、各種輔料 | G+菌類:桿狀為主(耐干燥菌屬),如:芽孢桿菌、棒狀桿菌、變形桿菌、乳酸桿菌屬等。 | 監控物料微生物含量;物料凈化處理等。 |
人員污染 | 打噴嚏、頭發皮膚脫落等 | G+菌類(球狀為主),如:葡萄球菌屬、鏈球菌屬、微球菌屬等。 | 規范人員更衣程序和潔凈區行為、消毒流程、加強管理等。 |
設施污染 | 墻壁天花板、壓縮空氣等 | G+菌類:桿狀為主(耐干燥菌屬)芽孢桿菌屬等。 | 規范潔凈區消毒殺菌流程等。 |


