臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

一、試劑和緩沖液配制

1、胎牛血清（氯化十六烷基吡啶）

（1）解凍胎牛血清

（2）在56℃加熱30分鐘（脫補(bǔ)體作用，蓋上瓶）

（3）取25ml上述液體放在無菌的50ml的falcon里分餾

（4）在-20℃冰凍餾份

2、磷酸鹽緩沖液（PBS）

（1）無鈣鎂離子的100ML的PBS（10×）（生命技術(shù)）

（2）900ML蒸餾水

（3）2克葡萄糖

（4）在無菌的FALCON里過濾，分餾，在-20℃冰凍

3、膠原蛋白酶（0.2%在PBS溶液里）

（1）把0.2克的膠原蛋白酶溶解于100ML的PBS溶液里

（2）在暗箱（鋁箔）里混合10分鐘

（3）用氫氧化鈉1N調(diào)整溶液PH值至7.40

（4）過濾（0.22U）

（5）分餾和冰凍在-20℃

4、保存和運(yùn)輸臍帶的緩沖液

（1）PBS 50ML

（2）多粘菌素E，抗敵霉素[多肽類抗生素] 1ML

（3）青霉素G 1ML

5、培養(yǎng)基

（1）M199“stock”M199 Earle 10× 100ml，蒸餾水 900ml

（2）M199“完全”

谷氨酰胺 0.2M 1ML

羥乙基哌嗪乙磺酸 1M 1.5ML

37.5%碳酸氫鈉（W/V） 1.8ML

青霉素 1ML

胎牛血清（加熱至56℃，離心） 20ML

M199“stock” 加至100ML

在+4℃下保存1周

二、細(xì)胞培養(yǎng)

1 術(shù)前1天

（1）取一滴纖維結(jié)合蛋白覆蓋有蓋培養(yǎng)皿（35MM，7個(gè)/根臍帶）

（2）準(zhǔn)備3個(gè)裝有50ML保存臍帶緩沖液的容器

2 手術(shù)當(dāng)天

（1）用一個(gè)容器裝50ML生理纖溶酶，保存在37℃下（bain-marie）

（2）術(shù)前準(zhǔn)備

取一根臍帶（離體3個(gè)小時(shí)內(nèi)，平均1小時(shí)，剪去夾傷部位）

2個(gè)50ML注射器，1個(gè)30ML注射器和1個(gè)10ML注射器

1個(gè)止血鉗，2根插管，14號線2CM長，消毒巾，消毒手術(shù)刀和無菌手套

手術(shù)區(qū)域準(zhǔn)備：一塊床單和無菌手套封套

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