細胞培養常見問題及其解決

1. 如何選用特殊細胞系培養基？

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始。

2. 何時須更換培養基？

視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。

3. 可否使用與原先培養條件不同之培養基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基， 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。

4. 可否使用與原先培養條件不同之血清種類？

不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6. 培養細胞時應使用5% 或10% CO2？或根本沒有影響？

一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10% CO2；當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5% CO2 培養細胞。

7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別？

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。

如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

8. 細胞之接種密度為何？

依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

9. 懸浮性細胞應如何繼代處理？

一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時， 可將培養角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。

10. 冷凍管應如何解凍？

取出冷凍管后， 須立即放入37℃水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。

11. 細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO？

除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15 ml新鮮培養基之培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

12. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于-20 ℃，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。

13. 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm)，5-10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。

14. 細胞冷凍培養基之成份為何？

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。

15. DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4℃， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。

16. 冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

17. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

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