樹突狀細胞(dendritic cell,DC) 的體外制備

樹突狀細胞(dendritic cell,DC) 是一類具有樹枝狀突起的抗原 呈遞細胞，其分布廣泛，由骨髓中的髓性多能干細胞發育而成，在免疫應答過程中至關重要。它是原發性混合淋巴細胞反應中的主要刺激細胞，可激活Th 細胞發生增殖反應，而且還能刺激產生TC 細胞。樹突狀細胞呈遞抗原給T 細胞提供穩定的微環境。

基本原理
本文應用細胞因子 GM-CSF 和IL-4 使血液中單核細胞分化成樹突狀細胞，并用IFN-α促進樹突狀細胞的成熟。
試劑和材料
● 新鮮的外周（肝素）抗凝血液
● 淋巴細胞分離液。無鈣鎂HanKs(CMF-HanKs)液
● 制劑：人重組GM-CSF(hrGM-CSF)。hrIL-4 hr IFN-α。
●培養液：
（1） RPMI1640 全培基：RPMI1640+10% 胎牛血清（ FCS、熱滅活）+2mmol/LL-谷氨酰胺+100IU/ml 青霉素+100μg/ml 鏈霉素+1g/L 非必需氨基酸+1 mmol/L 丙酮酸鈉+5×105 mol/L 2 巰基乙醇。
（2） RPMI1640/IL-4/GM-CSF:即RPMI 全培基+IL-4(40ng/ml)+GM-CSF(50ng/ml).
（3） RPMI1640/IFN-α:即RPMI 全培基+ IFN-α（1 ~ 10ng/ml）。

器皿及儀器
培養瓶（25 ml 和75 ml）CO2 孵箱、光學顯微鏡、血細胞計數器、垂直氣流超凈臺、離心機 等。

3、培基第3 天換液，輕輕吸去原培養液，加入等量含有IL-4 和GM-CSF 的新鮮1640 培氧液，繼續置CO2 孵箱中培養。
4、促樹突狀細胞成熟：單核細胞經與IL-4 和GM-CSF 的共同孵育，7 天左右使其分化成樹突狀細胞，但并未成熟。此時輕輕吸去含有IL-4 和GM-CSF 的1640 培養液，更換等量的含有IFN-α的RPMI1640 培養液，繼續置5%CO2 孵箱中，37℃培養，至第9 天時可獲得成熟的樹突狀細胞。

質控與提示
1、細胞活性：用胎盼藍拒染法檢測，至少應有90%的細胞具有活性。
2、細胞分化能力檢測：單核細胞開始培養時，細胞貼附于塑料培養瓶壁上，用抗CD14 熒光抗體標記檢測，細胞純度均應為90% ~ 100%，當用IL-4 和GM-CSF 孵育7 天和改用IFN-α孵育至第9 天時，單核細胞分化為樹突狀細胞并不斷趨向成熟，此時細胞不再貼壁生長，也不再表達CD14 抗原；但能高水平表達MHC-Ⅱ類抗原和CD1а抗原。
3、許多種類的誘導劑都可用于人脊髓細胞轉化成樹突狀細胞。
4、單核細胞，如來源于骨髓的CD34+細胞或來源于臍血的CD34+細胞等不同的始動細胞，均可用于樹突狀細胞的分化培養。
5、此項技術基于單核細胞貼壁而設計，也可用塑料培養袋培養，防止單核細胞的貼壁，但
分離方法要改變為沉降法。