微生物實驗室菌種管理
1. 前言
微生物實驗室菌種處理和保藏程序應(yīng)標準化,使盡可能減少菌種污染和生長特性的改變。按統(tǒng)一操作程序制備的菌株是微生物試驗結(jié)果一致性的重要保證。
目前中國藥典還在推進ICH的國際協(xié)調(diào),還沒有達成菌株互認。中美雙報時,從減輕工作量考慮,建議黑曲霉用ATCC和CMCC兩種菌株(黑曲霉和巴西曲霉從基因測序角度來說兩者有不同),其他的用ATCC菌株,以避免申報時受影響。
2. 定義
2.1 標準菌株:由中國食品藥品檢定研究院認可,可溯源至中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心(CMCC)或美國菌種保藏中心(ATCC)的冷凍干燥菌。
2.2 標準儲備菌株:用標準菌株制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌株,用于傳代及制備工作菌株。
2.3 工作菌株:用標準菌株或傳代用的菌株接種至瓊脂斜面培養(yǎng)或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后,作為日常工作使用的菌株(菌種)。
2.4 菌株的代:將菌株接種至一新鮮培養(yǎng)基,每萌發(fā)一次即稱為一代,從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。
3. 程序
3.1 管理要點:
3.1.1 檢定菌應(yīng)有專人負責(zé)管理,詳細做好菌種購進、使用、傳代、純化、銷毀記錄。
3.1.2 微生物檢驗用的檢定菌應(yīng)從來自認可的國內(nèi)或國外菌種保藏機構(gòu)的標準菌株,或使用與標準菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株,例如美國菌種收集中心(ATCC)和中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心(CMCC)。
3.1.3 檢定菌可以是安瓿,也可以是標明代數(shù)的斜面,或者是凍存管。
3.1.4 菌株傳代次數(shù)不得超過5代。
3.1.5 所有菌的暴露操作都必須在生物安全柜中進行。
3.2 菌種的購進、接收登記
3.2.1 由微生物實驗室根據(jù)需要提出采購需求,倉庫從上述指定單位訂購。
3.2.2 由專人負責(zé)購入菌種的接收登記,所有菌種均由專人上鎖保存。收貨時,首先應(yīng)檢查安瓿的數(shù)量和名稱及每一支安瓿的完整性。正確無誤,在專門的菌種登記臺帳上記錄購入菌種名稱、代號、傳代次數(shù)、來源、數(shù)量、日期、貯藏條件、保管人,并在菌種容器上貼上標簽。登記放入冰箱上鎖保存(斜面與安瓿于2~8℃保藏,凍存管于-20℃保藏,或參照說明書條件儲存),在使用時間進行期間核查,-80℃保存的菌株核查時間一般為2年一次。
3.3 使用工作菌種的名稱、代號
菌種名稱 | 中國藥典 | 國外藥典 | 縮寫 |
菌種編號 | |||
金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) | CMCC(B)26003 | ATCC 6538、NCIMB9518、CIP4.83、NBRC13276 | Sa |
銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) | CMCC(B)10104 | ATCC 9027、NCIMB8626、CIP82.118、NBRC13275 | Pa |
大腸埃希菌 (Escherichia coli) | CMCC(B)44102 | ATCC 8739、NMB 8545、CIP 53.126、BRC 3972 | Ec |
乙型副傷寒沙門菌 (Salmonella paratyphi B) | CMCC(B)50094 | ATCC 14028 | Sp |
枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) | CMCC(B)63501 | ATCC 6633、NCIMB8054、CIP52.62、NBRC3134 | Bs |
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) | CMCC(B)64941 | ATCC11437或ATCC19404、NBRC 14293、CIP 79.3、NCTC 532 | Cs |
白色念珠菌 (Candida albicans) | CMCC(F)98001 | ATCC 10231、NCPF3179、IP48.72、NBRC1594 | Ca |
黑曲霉(Aspergillus niger)/巴西曲霉(巴西曲霉) | CMCC(F)98003 | ATCC16404、IMI149007 IP1431.83、NBRC 9455 | An/Ab |
3.4 菌種的傳代、保藏
3.4.1 菌種的傳代
3.4.1.1 菌種的傳代次數(shù)不超過5代(從菌種保藏中心獲得的凍干菌種管為0代,凍干的原始菌種開啟后復(fù)蘇為第1代)。菌種的復(fù)蘇與傳代接種在陽性室生物安全柜操作臺內(nèi)進行。
3.4.1.2 試驗用菌種的培養(yǎng)傳代方法包括凍干菌復(fù)蘇、斜面菌種傳代、液體接種制備菌懸液、菌液。
3.4.1.3 菌種傳代、保存、使用
3.4.2 菌種的編號
如5.3表里的菌種的批號由C/A-菌種拉丁文名稱開頭字母的縮寫(2位)-W(G)傳代次數(shù)(n)-日期(均為2位)-支數(shù)五部分組成,“C”代表“CMCC”,“A”代表“ATCC”,“W”代表工作用菌株,“G”代表標準儲備用菌種。如:21年2月3號制備的ATCC金黃色葡萄球菌第三代傳種,工作用菌種和傳種用菌種均需傳1支,則批號分別為“A-Sa-W3-210203-01”與“A-Sa-G3-210203-01”。其他菌種由菌種第一個單詞拉丁文名稱開頭兩位+第二個單詞拉丁文名稱開頭一位(3位)組成,其余部分和2位的保持一致。
3.4.3 菌種的保藏
3.4.3.1斜面低溫保藏法:
經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面上,作為工作菌株(標簽樣式參考表1標準儲備菌株標簽)。按規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng),待充分生長后,將培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙包好,為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā),延長保藏時間,可將菌種保藏管的塞子換成橡膠塞,編號,貼簽,放在2~8℃左右的冰箱中保藏,銅綠假單胞菌放在室溫下保藏。斜面低溫保藏法有效期為一個月。
3.4.3.2甘油冷凍管保藏法:
將待保藏菌株接種平板或瓊脂斜面或液體培養(yǎng)基中,適宜溫度下培養(yǎng)適宜時間后。調(diào)整菌液濃度,一般加入微生物數(shù)量為105~107/ml,向已制備好的菌懸液中加含無菌甘油的TSB培養(yǎng)基(甘油最終濃度20%),使內(nèi)容物充分混合,分裝于無菌小管,貼好標簽。制備好的甘油保藏管于-20℃以下保存,有效期為1年;-80℃以下保存,有效期為5年。
3.4.4 檢測和環(huán)境檢出菌
3.4.4.1 保存范圍:
序號 | 微生物 |
1 | A/B級出現(xiàn)的超標微生物 |
2 | 環(huán)境監(jiān)測中超出接受標準的微生物 |
3 | 無菌陽性檢出的微生物 |
4 | 模擬灌裝、水系統(tǒng)及微生物限度檢測超標的微生物 |
5 | 實驗室潔凈區(qū)年度優(yōu)勢菌落 |
6 | 其他需要保存的菌種 |
3.4.4.2 保存方法:以甘油冷凍管保藏法為例,通常適用于需長期保存的菌種。
? 菌懸液制備:可參照下表
微生物 | 程序 |
細菌和酵母菌 | 用無菌接種環(huán)劃取待保藏環(huán)境檢出菌平板上的單菌落至100mL TSB培養(yǎng)基中,適宜溫度下培養(yǎng)適宜時間后(細菌30~35oC,18-24h,酵母菌20~25 oC,2~3天),將培養(yǎng)結(jié)束的TSB與等體積40%無菌甘油混合均勻。40%甘油(例如在250mL取樣玻璃瓶中加入40mL甘油和60mL純化水)需經(jīng)121oC蒸汽滅菌15分鐘。 |
霉菌 | 使用移液器吸取5mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液于霉菌平板中,使用無菌接種環(huán)刮落孢子,收集懸液至15mL或者50mL無菌離心管中,與等體積40%無菌甘油混合均勻。 |
? 用移液槍分裝于無菌甘油冷凍管,每管1.0mL,放于凍存管盒,并作好標記,置于-80℃以下超低溫保存箱保存,有效期5年。
? 流水號和《微生物鑒定登記臺賬》的流水號保持一致,以方便溯源,流水號的命名方式為4位年+兩位月+兩位日+兩位序號組成,例如2021092001,表示2021年9月20日第一份登記樣品。注:環(huán)境檢出菌在流水號前加EM方便年度統(tǒng)計。
? 環(huán)境檢出菌甘油冷凍管編號:流水號+編號(三位阿拉伯?dāng)?shù)字),如EM2021092001-001表示2021年9月20日第一份環(huán)境檢出菌登記樣品第1支甘油冷凍管。
? 填寫《環(huán)境菌制備和使用記錄》。
3.4.5.1商業(yè)派生菌株的保存和有效期參照其使用說明執(zhí)行。
3.4.6 菌液和菌懸液有效期
3.4.6.1 培養(yǎng)結(jié)束后,菌液均于2-8℃冰箱中保存(制備好的菌懸液亦同樣保存)。
3.4.6.2 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌、生孢梭菌等的菌液在規(guī)定貯存條件下的有效期為30天。
3.4.6.3 黑曲霉菌液在規(guī)定貯存條件下的有效期為1個月。
3.4.6.4 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌、生孢梭菌等的菌懸液,若在室溫下放置,應(yīng)在2小時內(nèi)使用;若保存在2~8℃,在24小時內(nèi)使用。黑曲霉菌懸液在2~8℃冰箱中保存,有效期為7天。
3.4.7 菌種傳代的記錄寫在《菌種傳代記錄》上,菌懸液記錄寫在《菌懸液制備及使用記錄》上。
3.5 檢定菌的使用
3.5.1 質(zhì)量檢驗須使用菌種,由微生物檢驗員提出申請,經(jīng)主管同意后向保管人員領(lǐng)取。
3.5.2 非檢驗?zāi)康幕蚱渌麊挝灰褂镁N,須得到質(zhì)量部負責(zé)人的同意。
3.5.3 正常檢驗工作,只能使用工作用菌種,商業(yè)派生菌株只能用作工作菌株,從3代開始使用,不超過5代。
3.5.4 檢定菌種由專人保管,領(lǐng)用人領(lǐng)用菌種,應(yīng)做好菌種領(lǐng)用記錄。
3.6 廢棄菌種、菌懸液、菌液的處理
3.6.1 廢棄菌種、菌懸液、菌液類型
(1)新一代的菌種培養(yǎng)好后,原批號的傳種用菌種、工作用菌種作為廢棄菌種。
(2)工作用菌種在使用過程中發(fā)現(xiàn)異常情況時,作為廢棄菌種。
(3)菌液超過有效期后作為廢棄菌液。
(4)制備好的菌懸液使用結(jié)束后,即作為廢棄菌懸液。
(5)商業(yè)派生菌株使用結(jié)束后作為廢棄菌液。
3.6.2 廢棄的菌種、菌液、菌懸液于121℃滅菌30分鐘后或126℃滅菌60分鐘棄去。
3.6.2.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌等的菌種在傳種結(jié)束后1~3個工作日內(nèi)滅菌后棄去。
3.6.2.2 黑曲霉菌種在傳種結(jié)束后1~3個工作日內(nèi)滅菌后棄去。
3.6.2.3 舊批號的菌懸液在新批號的菌懸液制備培養(yǎng)好后2個工作日內(nèi)滅菌后棄去。
3.6.2.4 菌液使用結(jié)束后,在1~3個工作日內(nèi)于121℃濕熱滅菌30分鐘或126℃滅菌60分鐘后棄去。
3.6.2.5 所購進菌種,傳代至第5代用后就需做銷毀處理,并做好詳細記錄。
3.6.3 按照本公司實驗室廢棄物相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
3.7 記錄
3.7.1 菌種的轉(zhuǎn)種、傳種、使用及滅菌處理必須有文字記錄,記錄內(nèi)容包括操作日期、操作人、復(fù)核人、菌種名稱,廢棄菌種批號、菌懸液、菌液的處理及有無異常情況等。
3.7.2 菌種等記錄歸檔保存3年。
3.8 注意事項:
3.8.1 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、以及菌種管的塞子是否松動或生霉,如有異常應(yīng)及時處理。
3.8.2 每當(dāng)移植菌種時,各菌的編號、批次及所用培養(yǎng)基,經(jīng)認真核對無誤。
3.8.3 每次移植培養(yǎng)后,應(yīng)與原種的編號、名稱逐一核對,檢查培養(yǎng)特征無誤時再繼續(xù)保藏。
3.8.4 某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后,延遲期較長,需連續(xù)兩次傳代培養(yǎng)才能正常生長。
3.8.5 冷凍菌種一旦解凍傳代后,不得重新冷凍和再次使用。
3.8.6 工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴格控制,不得超過5代。


