水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定——液相色譜-串聯質譜法（二）
2.4 樣品制備
2. 4. 1 鮮活水產品
2.4.1. 1 提取
稱取5.00 g已搗碎樣品于50 mL離心管中，加入200 μL混合內標標準溶液(2. 2. 19)，加入11 mL 乙腈，超聲波振蕩提取2 min，8 000 r/min勻漿提取30 s，4 000 r/min離心5 min，上清液轉移至25 mL 比色管中；另取一 50 mL離心管加入11 mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10 s，洗滌液移入前一離心管中，用玻棒搗碎離心管中的沉淀，渦旋振蕩器上振蕩30 s，超聲波振蕩5 min，4 000 r/min離心5 min，上清液合并至 25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，搖勻備用。
2.4.1.2 凈化
移取5. 00 mL樣品溶液加至已活化的中性氧化鋁柱(2. 2.14)上，用KD濃縮瓶接收流出液，4 mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，45°C旋轉蒸發至約1 mL，殘液用乙腈定容至1.00 mL，超聲波振 蕩5 min，加入1. 0 mL 5 mmol/L乙酸銨，超聲波振蕩1 min，樣液經0. 2呻濾膜過濾后供液相色譜-串 聯質譜測定。
2.4.2 加工水產品
2. 4. 2. 1 提取
稱取5.00 g已搗碎樣品于100 mL離心管中，加入200μL混合內標標準溶液(2. 2. 19)，依次加入 1 mL鹽酸羥胺(2. 2. 9)，2 mL對-甲苯磺酸(2. 2. 10).2 mL乙酸銨緩沖溶液(2.2.6)和40 mL乙腈，勻 漿2 min(10 000 r/min)，離心3 min(3 000 r/min)，將上清液轉移到250 mL分液漏斗中，用20 mL乙腈重復提取殘渣一次，合并上清液。于分液漏斗中加入30 mL二氯甲烷、35 mL水，振搖2 min，靜置分 層，收集下層有機層于150 mL梨形瓶中，再用20 mL二氯甲烷萃取一次，合并二氯甲烷層，45°C旋轉 蒸發近干。
2.4.2.2 凈化
將中性氧化鋁柱(2. 2. 14)串接在陽離子交換柱(2. 2. 13)±方。用6 mL乙腈分3次(每次2 mL)，用 渦旋振蕩器渦旋溶解上述提取物，并依次過柱，控制陽離子交換柱流速不超過0.6mL/mm，再用2 mL乙腈淋洗中性氧化鋁柱后，棄去中性氧化鋁柱。依次用3 mL體積分數為2%的甲酸溶液、3 mL乙腈淋洗陽 離子交換柱，棄去流出液。用4 mL體積分數為5%的乙酸銨甲醇溶液(2. 2.12)洗脫，洗脫流速為 1 mL/min，用10 mL刻度試管收集洗脫液，用水定容至10. 0 mL，樣液經0. 2μm 濾膜過濾后供液相色譜-串聯質譜測定。
2.5 測定
2.5. 1 液相色譜-串聯質譜條件
a） 色譜柱:C18柱，50 mmX2.1 mm（內徑），粒度3μm；
b） 流動相：乙腈+5 mmol/L乙酸銨= 75+25（體積比）；
c） 流速：0. 2 mL/min；
d） 柱溫：35°C；
e） 進樣量：10 μL；
f） 離子源：電噴霧ESI，正離子；
g） 掃描方式：多反應監測MRM；
h） 霧化氣、窗簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮氣，使用前應調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求；
i） 噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應優化至最優靈敏度；
j） 監測離子對:孔雀石綠m/z 329/313（定量離子）.329/208；隱色孔雀石綠m/z 331/316（定量離子），331/239；結晶紫m/z 372/356（定量離子），372/251；隱色結晶紫m/z 374/359（定量 離子）、374/238；氘代孔雀石綠m/z 334/318（定量離子）；氘代隱色孔雀石綠m/z 337/322（定 量離子）。
2.5.2 液相色譜-串聯質譜測定
按照2. 5. 1液相色譜-串聯質譜條件測定樣品和混合標準工作溶液（2. 2. 20），以色譜峰面積按內標法 定量，孔雀石綠和結晶紫以氘代孔雀石綠為內標物計算，隱色孔雀石綠和隱色結晶紫以氘代隱色孔雀石綠 為內標物計算。在上述色譜條件下孔雀石綠、氘代孔雀石綠、結晶紫、氘代隱色孔雀石綠、隱色孔雀石綠和 隱色結晶紫的參考保留時間分別為2. 27 min、2. 30 min，2. 88 min、5.21 min，5. 31 min、5. 61 min，標準溶液的離子流圖參見附錄A中圖A. 1。
2.5.3 液相色譜-串聯質譜確證
按照2. 5.1液相色譜-串聯質譜條件測定樣品和標準工作溶液，分別計算樣品和標準工作溶液中非定量離子對與定量離子對色譜峰面積的比值，僅當兩者數值的相對偏差小于25%時方可確定兩者為同一物質。
2.6 空白試驗
除不加試樣外，均按2. 4、2. 5步驟進行。
2.7 結果計算和表述
按式（1）計算樣品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫和隱色結晶紫殘留量。計算結果需扣除空白值。
式中：
X——樣品中待測組分殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）；
c ——孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫或隱色結晶紫標準工作溶液的濃度，單位為微克每升（μg/L）；
Csi——標準工作溶液中內標物的濃度，單位為微克每升（μg/L）；
Ci——樣液中內標物的濃度，單位為微克每升（μg/L）；
As——孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫或隱色結晶紫標準工作溶液的峰面積；
A ——樣液中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫或隱色結晶紫的峰面積；
Asi——標準工作溶液中內標物的峰面積；
Ai——樣液中內標物的峰面積；
V ——樣品定容體積，單位為毫升（mL）；
m——樣品稱樣量，單位為克（g）。
本方法孔雀石綠的殘留量測定結果系指孔雀石綠和它的代謝物隱色孔雀石綠殘留量之和，以孔雀石綠表示。
本方法結晶紫的殘留量測定結果系指結晶紫和它的代謝物隱色結晶紫殘留量之和，以結晶紫表示
2.8 方法檢測限
本方法孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫的檢測限均為0. 5μg/kg。
文章來源：《水產品獸藥殘留限量及監測方法查詢手冊》
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